三疣梭子蟹LGBP基因的克隆与组织表达【开题报告】

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1、毕业论文开题报告水产养殖三疣梭子蟹LGBP基因的克隆与组织表达一、选题的背景与意义三疣梭子蟹是我国大型海养蟹类，具有十分重要的经济价值和营养价值，也是我国沿海水产养殖重要的经济种。三疣梭子蟹（Portunustriuberbuculatus）属于甲壳纲（Crustacea）、十足目（Decapoda）、梭子蟹科（Portunuidae）、梭子蟹属（Portunus），地方名有梭子蟹、枪蟹、海螃蟹、水蟹等。随着水产养殖业的全面发展，三疣梭子蟹的养殖也在沿海蓬勃兴起，养殖规模日趋增大，其病害也随之多起来，目前三疣梭子蟹的病害对其养殖产量造成了不可忽视的损失，因

2、此，对于三疣梭子蟹的病害防治和研究十分必要。目前，对三疣梭子蟹的研究在分子生物学方面已经展开，为我们了解三疣梭子蟹提供了很大的帮助，但有关梭子蟹病害防控方面的研究资料还很少，主要集中在对病原的分离鉴定（许文军2005；王国良2006）、疾病的诊断及防治技术研究（赵青松2005；金珊2006）等，而有关免疫学方面的研究几乎没有。三疣梭子蟹由于无特异性免疫，因此其先天免疫的“非己”识别更为重要，这种“非己”识别是因为存在某些特异性的模式识别受体(PRRs)，它能够识别并结合微生物表面保守的、而在宿主中又不存在的病原相关分子模式(PAMPs)，如脂多糖（LPS）

3、、肽聚糖、脂磷壁酸、甘露聚糖、病毒dsRNA、细菌DNA等(GU，2001)。由于这些大分子对微生物的存活是必需的，因此微生物不能通过改变PAMPs来避免被先天免疫系统识别(DU，2007)。目前，对先天免疫识别的研究主要集中在哺乳动物（Medzhitov1997；Levashina2001；Liu2002）、昆虫（Werner2000；Gottar2002；Kanost2004)、线虫(Levashina2001)等，而水产动物模式识别受体的研究相对较少，主要针对淡水螯虾、凡纳对虾、南美白对虾、中国明对虾等虾类(Lee2000；Su2004；王金星200

4、4；Cheng2005；梁虹2006；Chiu2007)和扇贝（苏建国2004，胥炜2005）、中华绒螯蟹（Zhao2009）等。LGBP（Lipopolysaccharideandbeta-1，3-glucanblindingprotein），即脂多糖-β-1，3-葡聚糖结合蛋白，它能够识别G-细菌和真菌的细胞壁多糖成分脂多糖和β-1，3-葡聚糖。在异物侵入机体时，LGBP不仅能够促进血淋巴细胞的吞噬、黑化、包囊、凝集等作用，而且还可以激活蛋白酶级联反应，引起抗菌肽的合成(Yuetal，2002），因此，它在无脊椎动物的免疫系统中占有重要地位。本项目对三

5、疣梭子蟹LGBP基因进行克隆与表达研究，不仅对深入了解三疣梭子蟹先天性免疫功能和调节机制、丰富和发展无脊椎动物免疫学的内容具有重要的理论意义，而且对三疣梭子蟹免疫增强剂的研发及水产动物疾病的防治都具有重要的指导价二、研究的基本内容与拟解决的主要问题研究基本内容：1、三疣梭子蟹LGBP基因的克隆和序列分析；2、LGBP在三疣梭子蟹血细胞、鳃、肝胰腺、心脏、肌肉、性腺等主要组织中的表达差异。拟解决的主要问题：1、三疣梭子蟹LGBP基因的序列及氨基酸序列结构特征；2、LGBP在三疣梭子蟹各主要组织中的表达调控规律。三、研究的方法与技术路线：研究的方法:1.试验材

6、料：三疣梭子蟹，溶藻弧菌，酵母菌2.试剂与药品：mRNA纯化试剂盒，RACE反应试剂盒，TaqDNA聚合酶，0.5mlPCR反应管等。3.主要仪器：微量移液器，台式高速冷冻离心机，台式摇床，磁力搅拌器，水平凝胶电泳槽，稳压电泳仪，微波炉，紫外凝胶成像系统，恒温水浴等。4.细菌刺激实验：溶藻弧菌和酵母菌于实验前一天活化，两种菌高温高压灭活后分别配成107cell·ml-1备用，使用前等比例混合两种菌液。用混合菌悬液刺激健康三疣梭子蟹，定时取健康蟹和刺激蟹的血细胞等组织用于总RNA的提取和其它实验。5.三疣梭子蟹总RNA的提取：采用上海博星Unizol试剂提取

7、三疣梭子蟹总RNA，具体方法参照说明书。提取的总RNA经紫外分光光度计检测并确定其完整性后，在-80℃保存备用。6.LGBP基因片段克隆：查询GenBank数据库，结合其他动物同源LGBP基因的保守序列设计简并引物，以三疣梭子蟹血细胞cDNA为模板进行PCR扩增，扩增到的DNA片段连接到T载体，转化感受态细胞后进行测序。7.LGBP基因全长cDNA克隆：用RACE方法克隆目的基因。比对以上实验得到的LGBP部分序列与其他无脊椎动物LGBP基因的同源性，根据此测得序列设计正向和反向特异性引物，用于5′-RACE和3′-RACE方法克隆LGBP基因的5′末端和

8、3′末端序列，最后拼接获得LGBP基因的全长cDNA。8.LGBP