分子技术在湿地微生物群落解析中的应用

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1、生态环境学报2010,19(4):974-978http://www.jeesci.comEcologyandEnvironmentalSciencesE-mail:editor@jeesci.com分子技术在湿地微生物群落解析中的应用11,21梁威，吴苏青，吴振斌1.中国科学院水生生物所//淡水生态与生物技术国家重点实验室，湖北武汉430072；2.中国科学院研究生院，北京100049摘要：人工湿地的研究和应用近年来受到了广泛重视。微生物是人工湿地系统的重要组成部分，其群落结构对于湿地的净化功能的发挥具有重要影响。与传统的微生物分析技术相比，分子生物学技术在解析人工湿地微生物群落结构时无需纯

2、培养，具有高效、快速、简便的特点，使其广泛应用于环境微生物的研究。文章综述了近年来在聚合酶链反应技术（PolymeraseChainReaction，PCR）基础上发展起来的几种新的分子生物技术，包括PCR-DGGE、LH-PCR、T-RFLP、PCR-SSCP和ARDRA，以及其在人工湿地微生物研究中的应用现状。通过这些分子技术，可以分析湿地处理特定废水过程中微生物的数量、丰度、多样性及优势种；鉴定湿地中特定功能菌群（如氨氧化细菌、反硝化细菌、除硫菌等）的数量、活动分布、空间变更及与污染物去除的关系；判断各种系统条件(如不同基质、植物、水力负荷等)的设置对微生物多样性和稳定性的影响。最后，对

3、分子技术在湿地领域的未来发展进行了展望。关键词：分子技术；微生物群落；人工湿地；现状；展望中图分类号：X172文献标识码：A文章编号：1674-5906（2010）04-0974-05人工湿地在过去的几十年中得到迅速发展。许链温度不同的原理，通过梯度变性胶将DNA分开。多研究表明，湿地微生物的作用是影响该系统去除与其它电泳系统相比，它不是基于核酸分子量的不污染物效率的重要因素之一，然而由于其复杂性及同将DNA片段分开，而是根据序列的不同将片段大分析方法的局限性使得人们在研究和设计湿地系小相同的DNA序列分开。当双链DNA分子在含梯度统时只能将其作为一个黑箱而忽视。近代分子生物变性剂(尿素、甲酰

4、胺)的聚丙烯酰胺凝胶中进行电学技术的发展克服了传统研究微生物时的培养需泳时，其解链的速度和程度与其序列密切相关，相求，为人工湿地微生物的多样性及其功能的深入分同碱基对数目的双链DNA分子由于碱基对组成的[1-3]析提供了一个崭新的途径。不同，解链所需要的变性剂浓度也不同，当某一双目前用于湿地微生物群落结构分析的技术主链DNA序列迁移到变性凝胶的一定位置，并达到其要有平板计数法、荧光染色法、Biolog微平板分析、解链温度时,即开始部分解链，解链程度越大，迁移微生物醌指纹法、磷脂脂肪酸(PLFA)谱图、荧光原阻力大，DNA分子的迁移速度随之减小，产生的迁[4-5]位杂交(FISH)技术等。近年来

5、，变性梯度凝胶电移阻力与电场力相平衡时，具有不同序列的DNA片泳、随机扩增多态性DNA标记、单链构象多态性等段则停留于凝胶的不同位置，形成相互分开的条带方法在湿地研究中也开始应用，对湿地中微生物的图谱。理论上只要选择的电泳条件足够精细，最低[6-7][8-10]研究起到显著的推动作用。本文针对当前应用于可检测到只有1个碱基差异的DNA片段。人工湿地研究中的主要分子技术进行综述，以期为1.2PCR-DGGE在人工湿地研究中的应用利用现代分子技术研究人工湿地的净化机理提供1.2.1微生物数量、丰度及多样性[11]参考。Dong等用PCR-DGGE技术鉴别分析用来处1PCR-DGGE(Polymer

6、aseChainReac-理猪圈废水的湿地基质中微生物的情况，得出菌种tionandDenaturingGradientGelElectro-的分布与总磷、硝酸盐、磷酸盐的浓度显著相关，phoresis)从进水到出水中微生物的多样性及丰度显著降低，1.1DGGE原理其优势种为Pseudomonassp.(假单胞菌),Arthrobac-DGGE(变性梯度凝胶电泳)技术是由Fischer和tersp.(节细菌属),Bacillussp.(杆状菌)。通过系统发Lerman于1979年最先提出的，主要是用于检测DNA育分析表明一部分16SrRNA的基因序列与不可培突变的一种电泳技术。1993年Muz

7、yers等首次将植的反硝化细菌具有极大的相关性，而这些反硝化DGGE技术应用于分子微生物学研究领域。DGGE细菌的活动对湿地中氮的去除起着重要的作用。[12]利用序列不同的DNA片段在聚丙烯酰胺凝胶中解Yin等利用DGGE技术分析处理受污染景观湖水基金项目：国家重大科技专项（2008ZX07106-003,2008ZX07316-004）；江苏省科技惠民项目（BE2008651）；中科院天津专项（