rd29a基因植物表达载体构建及四倍体刺槐再生诱导的研究

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1、F7Z‘3U8摘要不良环境如低温干旱盐渍，是影响农业生产和生态环境的一个非常重要的非生物胁迫因素。我国是一个水资源紧缺的国家，干旱和半干旱耕地面积占全国总耕地面积的38％；其次，低温冷害是我国南北方农业生产长年发生的灾害；除此之外，我国还有大片的盐渍土壤等待进～步的丌发利用。如何利用这些大面积的土地，提高农作物抗逆性是生物科学的一个重要研究课题。四倍体刺槐(Robiniapseudoacacia)是荒山造林的先锋树种，在改善环境、平原及山区发展圈养畜牧业以及植树造林等方面都能产生较好生态效益和经济效益。如能提高抗逆性，对西部大开发建

2、设中退耕还林，改善生态环境，发展圈养畜牧业具有十分重要的意义和广阔的市场前景。故本文通过四倍体刺槐根、茎、叶建立了一套完整的再生体系，为转基因工程育种提供了可靠的依据。rd29A基因对于旱、盐碱、寒冷都有抗御功能，因此，本项研究拟进行克隆拟南芥rd29A抗逆基因，构建植物表达载体，为植物抗逆基因转化提供可利用的基因。转rd29A基因的抗旱，抗盐、耐低温作物新品种的育成必将对提高作物的单位面积产量和扩大种植区域产生积极的推动作用，转rd29A基因的抗非生物逆境林木和草类新品种的育成将为我国的环境保护和美化带来可观的社会和生态效益以及经

3、济效益。本实验的完成对于植物品种改良具有重要意义，主要从两个方面进行了研究：(1)根据GenBank中已发表的rd29A基因的cDNA序列设计并合成了一对引物，PCR引物设计时根据后续构建植物表达载体的需要，在上游引物一端加入一个BamHI位点，在下游引物一端加入了Kpnl位点。通过RT—PCR的方法从低温处理的拟南芥总RNA中扩增出rd29A基因的全长cDNA片段。将其克隆到pMDl8一TvectoF中。经测序证明该片段与GenBank上报道的序列具有100％的同源性。克隆载体用B硼HI和KpnI双酶切，获取rd29A基因，将其连

4、接到中间载体DRTl01，再以单酶切HindlII消化，将其目的片断(rd29A和CaMV35S)与表达载体pCAMBIA3301在T。DNA连接酶的作用下进行连接，构建了由组成型启动子CaMV35S调控的rd29A基因的植物表达载体pCAMIADR3301，采用直接转化法将pCAMIADR3301导入根癌农杆菌菌株LBA4404，为利用rd29A基因改良植物抗逆性奠定了物质基础。(2)以四倍体刺槐的半木质化嫩枝为外植体，通过初始培养获得无菌苗后，选取无菌苗的不同部位作外植体，如幼嫩茎段、较老茎段、接触培养基的肥厚叶片、正常叶切片、

5、主根、侧根、根尖切段经不同培养基及激素诱导分化培养和生根培养，形成再生植株。结果表明，幼嫩茎段、肥厚叶片和根尖是比较好的外植体，茎段和叶片不经过暗培易产生不定芽，而根暗培15d转入光培产生不定芽效果好。尤以幼嫩茎段诱导不定芽效果最好，幼嫩茎段、肥厚叶片和根尖不定芽诱导率分别为89．O％、48．7％、40．9％；对于茎段和叶片而言，在不同激素中以6．BA、ZT年N2．4--D配合使用效果摄佳，最佳培养基为Ms培养基盐份+B5维生素4-3mg／L6BA+2mg／LZT+0．05mg，L2．4-D；而根尖不定芽诱导最佳培养基为Ms培养基+

6、1．0mg／L6BA+2．0mg／LNAA。在生根培养基中，I／2MS+0．5mg／LIBA生根率高达100％。本研究初步建立了一套高效的四倍体刺槐再生系统，为下一步进行农杆菌介导的遗传转化奠定了基础。关键词：rd29A基因；RT-PCR；植物表达载体；四倍体刺槐；不定芽诱导率；再生植株1lSummaryThebadenvironment，suchaslowtemperature，drought．salt，isaveryimportantnonbiologicalforcefactorinfluenceagriculturalpro

7、ductionandecologicalenvironment．ourcountryisanationthatwaterresourcesisinscarcity，dryandhalfdryfarmlandaccountsfor38％oftotalnationalfarmland；secondly，thelowtemperatureisadisastertonorthernagricultureinsouthinOUrcountrywhichtakeplaceregularly；Inaddition，OUrcountrystillc

8、ontainalotofsaltsoilneededtobeexploited．Howtomakeuseofthelandofthesebigareasandimprovethetoleranceofcropisanimportanc