人参皂甙rg3治疗食管癌分子机制的实验性研究

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1、AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofdoctorScreeningofMolecularMechanismsUnderlyingtheActivityofGinsenosideR93inEsophagusCancerBy：LUPeiSupervisor：Prof．SUNYanProf．FANGQingXiaOncologyFirstclinicalcollegeMarch2013mIIIKIIIIIHIIIItllllllH}Y2545230原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取

2、得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明学位论文作珊必?委争专考勺j学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅：本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名

3、单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。⋯文作嘞日期：乡。／夕年j～月≥D日摘要人参皂甙R93治疗食管癌分子机制的实验性研究摘要人参皂甙R93是从人参中提取的中药单体，研究表明人参皂甙R93具有抑制肿瘤细胞的增殖、浸润和转移等作用，R93抗肿瘤机理的研究是目前中草药抗肿瘤研究的热点之一。本研究主要包括：(1)利用MTT法、流式细胞术测定人参皂甙R邸对人食道癌EC9706细胞的生长抑制作用；采用免疫组化、RT-PCR和Westen-blot等方法分析人参皂甙R93对细胞周期蛋E]p21、p27、c—Myc、PCNA和Cyclin-D1等表达的影响，探讨人参皂甙R93抑带IEC9

4、706细胞增殖的分子机制。(2)采用AO／EB双染色和流式细胞术观察分析R93对EC9706细胞凋亡的影响，利用免疫组化、RT-PCR并lWesten．blot等方法分析人参皂甙R93对细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl．xL、p53、Fas和caspase．3表达的影响，探讨人参皂甙R93促EC9706细胞凋亡的分子机制。(3)采用原代培养的人脐静脉内皮细胞(Humanumbilicalveinendothelialcells，HUVECs)，利用MTT、流式细胞术、Transwelld、室、小管形成等方法观察R93对HUVECs的增殖、迁移、侵袭等方法，研究人参皂苷R93体外的抗血管生

5、成作用。(4)利用免疫细胞化学、RT-PCR、Western．blot等方法，对人参皂甙R93作用后EC9706食道癌细胞中血管生成相关分子MMP．2、MMP．9和VEGF的表达进行研究，探讨R邸对食道癌新生血管抑制的作用机制。结果显示：(1)50I．tmol／L人参皂甙R93即能抑制食管癌细胞EC9706的增殖，并且有摘要时间和剂量依赖性，人参皂甙R93作用后EC9706细胞中G0／G1期细胞数目依浓度递增逐渐增加，而S期和G2／M期细胞数目则依浓度增加而逐渐减少。R93作用后，Cyclin．D1和PCNA表达水平皆降低，p21和p27蛋白水平增高，p21蛋白的增高更明显。(2)20

6、0pmol／L、1001xmol／L、501xmol／L的R93对EC9706细胞凋亡的结果显示，作用48h后EC9706细胞凋亡百分数分别为35．19％，15．48％，8．16％，与对照组相比均有显著性差异，(P<0．01)，细胞凋亡率随R93浓度的增加而增加。Bax随着R93浓度的增加，表达量增加，Bcl．2变化不明显，Bcl．xL表达量减弱，Caspase．3、p53、Fas等表达量也随浓度增加而增加。(3)R93处理后可使HUVECs细胞形态改变，2001xmol／L时人参皂苷R93对HUVECs增殖有明显的抑制作用，501．tmol／L时可抑制HUVECs细胞迁移，R93处理

7、组与对照相比，HUVECs细胞形成的典型的微观样结构数目明显减少，且呈现一定的剂量依赖性。(4)免疫组化显示100I，tmol／L、200}tmol／LR93组VEGF在EC9706细胞中分别呈弱阳性和阴性，人参皂甙R93均能降低EC9706细胞MMP．2的表达水平，200I，tmol／L时能显著的抑制MMP．2的表达，并呈剂量依赖关系。本研究表明：(1)人参皂甙R93能够抑制食管癌细胞EC9706的增殖，主要是将食管癌细胞阻滞在GO／G1期，