异氟烷预处理促进大鼠随意型皮瓣存活及机制研究

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1、上海交通大学医学院◎博士学位论文异氟烷预处理促进大鼠随意型皮瓣存活及机制研究Isofluranepreconditioningincreasessurvivalofratskinrandom-patternflapsandunderlyingmechanism研究生：孙宇学科专业：麻醉学研究方向：吸入麻醉药与脏器保护指导教师：姜虹教授指导小组成员：朱也森教授徐辉教授黄燕副教授陈志峰副教授申请学位：博士答辩日期：2013年4月上海交通大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已

2、经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：≯·垆∞月j日上海交通大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密口，在年解密后适用本

3、授权书。本学位论文属于不保(请在以上方框内打“4”)学位论文作者签名：Ⅵj醐制萝蝴了日指导教师签名：、／名矢屯u、日期．弘()年中月_7日上海交通大学2010级博士学位论文异氟烷预处理促进大鼠随意型皮瓣存活及机制研究中文摘要临床上常用随意型皮瓣来覆盖各种外伤、溃疡、先天性畸形和肿瘤切除的创面和重建其结构。但是，由于随意型皮瓣缺乏知名血管，其存活主要依赖蒂部的血管网十分有限的供血和供氧，因此皮瓣的远端部分经常出现缺血甚至坏死。若能增加随意型皮瓣远端的缺血耐受能力，减少可能发生的缺血性坏死，无疑将具有重要的临床应用价值。及时形成新生血管，恢复灌注对

4、缺血皮瓣组织的存活与否起着至关重要的作用。血管内皮生长因子(VEGF)是一种强大的促血管新生因子，它能促进血管内皮细胞有丝分裂，增加内皮细胞渗透性和促进血管生成，进而起到促进组织愈合的作用。同样，血红素加氧酶。1(HO．1)作为降解血红素产生一氧化碳、铁和胆绿素的关键限速酶，也能减少骨骼肌的缺血坏死。但外源性VEGF和HO．1存在半衰期短、容易降解以及安全性等问题。如果在皮瓣缺血前即能诱导VEGF和HO．1表达，促进新生血管形成将有助于提高随意型皮瓣的存活。近年来，我们和其他的研究小组发现除了低氧以外，吸入麻醉药异氟烷的能调控低氧诱导因子一la

5、(HIF．1a)的表达以及靶基因的转录。而己知VEGF、HO．1都是HIF—la下游靶基因，且都部分参与了对皮瓣缺血损伤的保护效应，因此我们推测：吸入麻醉药异氟烷预处理可能对缺血皮瓣组织具有一定的保护效应，并且很可能是通过HIF．1a系统表达上调来实现的。本次实验中，我们将分别从离体和在体实验全面研究吸入麻醉药上海交通大学2010级博士学位论文异氟烷预处理是否能增加超长宽比随意型皮瓣的存活，并且通过基于慢病毒转染的RNAi技术来明确HIF．1cz在其中的地位。本课题研究共分为以下三个部分：第一部分大鼠HIF．1a序列的设计和siRNA慢病毒载体

6、的构建目的：构建能有效抑制大鼠皮肤成纤维细胞HIF．1tz基因表达的RNAi慢病毒载体(Lemivirus．HIF．1u．siRNA)，为后期研究HIF．1a蛋白在异氟烷预处理对缺血皮瓣保护作用中的地位奠定基础。方法：设计针对大鼠HIF．1a基因的RNAi序列，在此基础上构建能有效抑制大鼠HIF．10【基因表达的lemivirus．HIF．1(x．siRNA。转染大鼠皮肤成纤维细胞后通过qRT-PCR和westernblot进行鉴定。结果：成功构建了HIF．1仅．siRNA质粒并进行了慢病毒包装，得到了滴度为109TU／ml的lemivirus

7、—HIF．1a-siRNA。最后经qRT-PCR和westemblot进行鉴定证实lentivirus—HIF一1仪．siRNA对HIF．1s基因的干扰效率为85％。结论：构建I-HF．1a靶向siRNA重组表达载体能有效抑制大鼠皮肤成纤维细胞HIF—la基因的表达，因此可用于后续研究。第二部分异氟烷诱导HUVECs和人皮肤成纤维细胞HIF．1a表达上调及机制研究目的：以人脐静脉内皮细胞株(HUVECs)和人皮肤成纤维细胞株为研究对象，探讨吸入麻醉药异氟烷预处理是否能诱导HIF．1a及其下游靶基因的表达，并深入分析可能的信号机制。上海交通大学2

8、010级博士学位论文方法：qRT-PCR、ELISA和westernblot检测不同浓度异氟烷预处理或异氟烷处理后不同时间点IMF．1a、VEGF和H