质膜修复剂泊洛沙姆188对hemin诱导的神经元细胞自噬与凋亡的影响

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1、SOOCHOWUNIVERSITY硕士学位论文论文题目质膜修复剂泊洛沙姆188对hemin诱导的神经元细胞自噬与凋亡的影响研究生姓名王龙指导教师姓名陶陆阳（教授）专业名称免疫学研究方向神经创伤与修复论文提交日期2013年4月质膜修复剂泊洛沙姆188对hemin诱导的神经元细胞自噬与凋亡的影响中文摘要中文摘要目的：Hemin可以引起细胞质膜损伤并导致质膜完整性的破坏，并进一步导致继发性损伤的发生。本研究期望通过建立体外脑出血模型—hemin损伤模型，探索质膜破坏对脑出血后神经细胞死亡的影响，并探讨质

2、膜修复剂P188是否存在神经保护作用及其机制。方法：运用小鼠海马神经元HT22细胞系，采用适当浓度的hemin（30μM）建立体外出血模型。CCK-8试剂盒检测海马神经元HT22细胞的存活率；荧光染料碘化丙啶（PI）检测hemin诱导的质膜完整性的破坏程度；WesternBlot检测hemin处理后自噬相关蛋白LC3，Beclin1和凋亡相关蛋白Caspase-3，Bcl-2蛋白的表达；给予自噬抑制剂3-MA（10mM）及mTOR抑制剂Rapamycin（100nM）后，通过CCK-8及免疫细胞化

3、学技术检测自噬在神经细胞损伤中所起的作用；给予质膜修复剂泊洛沙姆188（P188；100μM）后，通过CCK-8检测P188对hemin引起的神经细胞损伤的影响；WesternBlot检测P188对模型中神经元自噬相关蛋白LC3，Beclin1和凋亡相关蛋白Caspase-3，Bcl-2的影响。流式细胞术检测P188对细胞内活性氧（ROS）变化的影响；给予抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）后，WesternBlot检测NAC对模型中神经元自噬相关蛋白LC3，Beclin1和凋亡相关蛋白Caspas

4、e-3，Bcl-2的影响。结果：（1）利用hemin法成功的建立了神经元细胞体外出血模型。CCK-8结果证实了hemin处理后对神经元细胞的损伤是剧烈的，并且具有时间及浓度相关性。PI荧光结果显示hemin处理后质膜完整性遭到破坏。（2）hemin可以诱导神经元细胞发生凋亡及自噬，且自噬在细胞死亡中扮演损害作用。WesternBlot结果显示，自噬相关蛋白LC3和Beclin1蛋白在hemin处理后逐步上升（P<0.05），凋亡相关蛋白Caspase-3也随时间地延长逐步上升，抗凋亡蛋白Bcl-2

5、显著减低（P<0.05）。在加入3-MA后，其损伤相对于单纯hemin处理明显降低，而Rapamycin则进一步加剧了hemin的损伤作用，提示自噬在hemin引起的神经损伤中扮演促进细胞死亡的作用。（3）质膜修复剂P188具有神经保护作用。在加入质膜修复剂P188后，PI阳性细胞数目明显减少（P<0.05），WesternBlot结果显示LC3，Beclin1I中文摘要质膜修复剂泊洛沙姆188对hemin诱导的神经元细胞自噬与凋亡的影响及Caspase-3蛋白的表达也明显的减低（P<0.05），

6、而Bcl-2的表达显著上升（P<0.05），免疫荧光技术结果显示TUNEL（+）/Beclin1（+）也明显的减少（P<0.05）。（4）P188可以减少细胞内ROS，这可能是其具有抗凋亡及抗自噬功能的机制之一。流式细胞技术检测细胞内活性氧（ROS）的表达水平，结果显示P188显著降低细胞内ROS的生成，而抗氧化剂NAC也显著减少ROS的产生。加入NAC后，WesternBlot结果显示LC3，Beclin1和Caspase-3蛋白的表达显著降低（P<0.05），Bcl-2蛋白的表达水平回升，而N

7、AC与P188联合给药时，与单独给NAC相比，其损伤程度无明显改善（P>0.05），且各种蛋白表达水平也无明显差异，提示P188可能是通过减少细胞内ROS的水平进而调节自噬及凋亡，从而起到神经保护作用。结论：1.Hemin对神经元细胞产生致死性损伤，且伴随有质膜的破坏。2.Hemin产生的神经细胞死亡伴随有自噬与凋亡的发生。3.自噬在神经元hemin处理中起损伤作用，即可能为自噬性细胞死亡。4.质膜修复剂P188对神经元hemin处理后具有保护作用。5.活性氧在hemin诱导神经损伤中起重要作用，

8、抑制活性氧的产生可以调节hemin诱导的自噬与凋亡。6.P188可以通过减少活性氧的产生，从而调节自噬与凋亡。关键词：脑出血；Hemin；自噬；凋亡；P188；活性氧作者：王龙指导老师：陶陆阳教授II质膜修复剂泊洛沙姆188对hemin诱导的神经元细胞自噬与凋亡的影响英文摘要Poloxamer188suppresseshemin-inducedautophagyandapoptosisinhippocampalneuronsAbstractObjective:Hemincancau