微生物菌种保藏技术进展

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1、微生物菌种保藏技术进展微生物菌种保藏菌种是进行微生物学研究和应用的基本材料，是发展生物工程的重要基础条件之一，是国家的重要生物资源。菌种保藏要求各保藏管理中心所保藏的菌种，必须具有该菌种的详细历史及有关实验资料。并对其所负责保藏的菌种均应采取妥善、可靠的方法保藏，避免菌种的污染或死亡。《中国微生物菌种保藏管理条例》，1986年微生物菌种保藏基本原理是在挑选优良纯培养物并使其处于休眠状态基础上，人为地创造一个有利于休眠的环境，使其长期保存后仍能保持菌种原有的优良特性。基本措施是低温、真空、干燥。

2、常用保藏方法定期移植法液体石蜡法真空冷冻干燥法-80℃低温冻结法液氮超低温冻结法定期移植法亦称传代培养保藏法，指将菌种接种于适宜的斜面培养基上，最适条件下培养，待得到健壮的菌体后，于4～6℃进行保存并间隔一定时间（3-6个月）进行移植培养的一种短期菌种保藏方法。操作步骤：斜面制备接种培养保藏斜面制备培养基配制分装灭菌摆放斜面接种培养细菌37℃，1-2d酵母28~30℃，2~3d丝状真菌26℃，5~7d保藏4~6℃，保藏3~6个月。方法总结操作简单，使用方便；对设备和人员要求不

3、高；可随时使用，便于观察菌种；工作劳动强度大，属短期保藏，保藏成本高；菌种传代频繁，易退化、污染。液体石蜡法亦称矿物油保藏法，定期移植保藏法的辅助方法。指将菌种接种在适宜的斜面培养基上，最适条件下培养至待得到健壮的菌体后注入灭菌的液体石蜡，使其覆盖整个斜面，再直立放置于低温（4～6℃）干燥处进行保存的一种菌种保藏方法。操作步骤：优质化学纯液体石蜡灭菌：液体石蜡预处理—121℃湿热灭菌30min，蒸发水分；—160℃干热灭菌2h；冷却至室温。斜面培养物制备灌注石蜡液面高出斜面顶部1cm

4、4～6℃，干燥处；保藏直立放置；保藏时间1～2年。方法总结操作简单，使用比较方便；对设备要求不高，对人员操作水平有一定要求；工作劳动强度大，保藏成本较高；菌种易退化、污染。真空冷冻干燥法指将保藏的菌种细胞或孢子悬浮于保护剂中，经预冻后在真空条件下使水分升华，再经真空封存后保存的一种长期菌种保存方法。安瓿管的准备清洗—选用中性玻璃材质的安瓿管；—2%盐酸浸泡8～10h，自来水冲洗至中性，蒸馏水冲洗2～3次；—置于烘箱中烘干。棉塞打棉塞，160℃定型2h；标签—激光打印标签，标明菌

5、株编号和保藏日期，大小约10×20mm。—喷码于安瓿管外，160℃固定20min。灭菌同一菌种安瓿管包在一起，121℃湿热灭菌30min.保护剂的准备保护剂：12%脱脂牛奶蒸馏水溶液，2～5ml/管；灭菌锅加热至沸腾，将牛奶管放入锅中，113℃灭菌20min；打开放气阀缓慢排出蒸汽，取出灭菌后脱脂牛奶试管，迅速放入凉水中冷却；30℃培养2天，无菌检查合格后备用。冻干样品制备制备斜面培养物；将保护剂用无菌吸管注入到斜面培养物上，用吸管刮取斜面上的菌体，使菌体均匀地悬浮在保护剂内。用长

6、毛细滴管将菌悬液分装到安瓿管内，0.1～0.2ml/管，操作时要把带有菌悬液的长毛细滴管直接插入安瓿管的底部，勿使菌液沾在管壁上。预冻制备菌悬液、经分装到进行预冻之间的时间不宜超过1h；分装完成后将安瓿管立刻放入－35～－40℃冰箱预冻1h，使菌液完全冻结；可采用分段式预冻，先将分装好的安瓿管置－20℃冻30分钟，再放入－80℃冰箱冻30min；采用离心式冻干装置时勿需预冻。真空干燥在开动真空泵后应使真空度在15min内达到66.5Pa，随后逐渐达到26.6～13.3Pa，在此条件下，样

7、品将保持冻结状态，其中水分则不断升华，干燥才能顺利地进行。终止干燥时间应根据下列情况判断：l安瓿管内冻干物呈酥块状或松散片状l真空度接近空载时的最高值l样品温度与管外温度接近l选用1～2支对照管，其水份与菌悬液同量，当其水分完全蒸发时视为干燥完结熔封将安瓿管的中上部用火焰烧软，拉成细颈；将安瓿管装到多歧管上，开启真空泵，当真空度达到1.33Pa时，用火焰在细颈处熔封，严格的密封会使安瓿管上产生一个小窝；拉管时注意火焰不要离菌体太近，以免影响菌体的活力。真空度检测用高频电火花检查各安

8、瓿管的真空情况，如管内呈现灰蓝色光，说明真空度符合要求。检查时高频电火花应射向安瓿管的上半部，切勿直接射向样品，以免影响其中的菌种。保藏4～6℃下避光保藏，一般可保藏8～10年。方法总结保藏、运输方便；保藏时间长(5～10年)；对设备要求高(真空冷冻干燥机、多歧管)，对人员操作水平要求高；冷冻干燥过程对菌体有损伤，需恢复培养。－80℃冰箱冻结法将菌种悬浮于保护剂中，在－80℃冰箱中冻结保存的一种长期菌种保藏方法。准备冷冻管准备保护剂（10%-