肝细胞癌患者石蜡包埋肝组织hbvcccdna的原位检测

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1、分类号R735.7学校代码10601密级编号1001012硕士学位论文肝细胞癌患者石蜡包埋肝组织HBVcccDNA的原位检测学科专业:病理学与病理生理学研究方向:乙型病毒性肝炎发病机制研究生姓名:胡双烨学号:Y1001012学位类型:科学学位导师姓名:钟彦伟研究员二O一三年六月独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得（注：如没有其他需要特别声明的，本栏可空）或其他教

2、育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日----------------------------------------------------------------学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解桂林医学院有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权桂林医学院可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印

3、、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国学术期刊（光盘版）电子杂志社、中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》、《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：导师签字：签字日期：年月日签字日期：年月日目录肝细胞癌患者石蜡包埋肝组织HBVcccDNA的原位检测……………………1中文摘要………………………………………………………………1ABSTRACT…………………………………………………………

4、…3英汉缩略词对照表……………………………………………………………5前言……………………………………………………………………61材料与方法………………………………………………………92结果…………………………………………………………………163讨论…………………………………………………………………234结论…………………………………………………………………27参考文献………………………………………………………………28综述……………………………………………………………………………33攻读学位期间发表的学术论文目

5、录…………………………………………59致谢……………………………………………………………………………60肝细胞癌患者石蜡包埋肝组织HBVcccDNA的原位检测中文摘要目的：原发性肝细胞癌(HCC)是一种常见的高度恶性肿瘤，其发病率位居我国癌症发病率的第二位。流行病学证实乙肝病毒(HBV)的感染是HCC发生的独立危险因素。共价闭合环状DNA（cccDNA）是HBV生命周期中重要的复制中间体，是乙型肝炎病毒前基因组RNA（pgRNA）的原始合成模板，已经被公认为HBV持续感染和肝脏进行性病理改变的根本原因。体外试验

6、及动物试验研究均提示HBVcccDNA与肝细胞癌变的发生密切相关。目前，肝组织内HBVcccDNA的定量检测方法随着PCR技术的发展和应用已日趋成熟，而人肝癌组织内HBVcccDNA的定位检测研究，国内外鲜见报道。本研究通过一种新型的原位检测方法，检测HCC患者癌及癌旁组织中HBVcccDNA的表达，探讨其在HCC中的意义，为临床上原发性肝细胞癌的预防和治疗提供新的理论根据。方法：收集20例北京302医院2011年9月-2012年9月期间住院的HCC患者癌及癌旁组织手术切除标本，经10%中性福尔马林固定,石蜡包

7、埋，5μm连续切片后使用。采用不降解质粒的ATP依赖的DNA(PSAD)酶消除松弛的环状HBVDNA（rcDNA）后,根据我国常见的HBV基因型B、C基因组全序列,设计引物4对，应用原位滚环扩增（RCA）的方法只扩增环状的DNA,再采用针对HBVcccDNA与HBVrcDNA结构上的差异所设计的5端地高辛标记的特异性引物进行直接原位跨缺口PCR，进一步扩增HBVcccDNA。通过免疫组织化学方法进行显色，在显微镜下观察HBVcccDNA在肝组织中表达及分布。以肝癌患者肝组织为例，设置无引物、无地高辛标记引物、无

8、Phi29酶和DNA聚合酶反应体系，以及非乙型肝炎病毒感染肝组织（包括健康成人肝组织5例，转基因小鼠肝组织2例，丙型1肝炎患者肝组织3例）作为阴性对照组。结果：20例肝细胞癌患者肝组织标本中有17例（85%）检测到HBVcccDNA阳性信号，为紫红色或紫蓝色呈团块状,定位于细胞核。肝癌患者癌组织及癌旁组织HBVcccDNA阳性率分别为10%(2/20)和85%(17/20),两者差异有