通脉醒脑滴丸对线栓法致脑缺血再灌注大鼠pi3kakt信号转导通路的影响

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1、http://www.paper.edu.cn通脉醒脑滴丸对线栓法致脑缺血再灌注大鼠PI3K/Akt信号转导通路的影响陈小睿，黄雷雷，孟宪丽*，唐光曦，李佳川成都中医药大学药理研究室，成都(610075)E-mail：icelolly@yahoo.cn摘要：目的：探讨中药复方制剂通脉醒脑滴丸防治脑缺血卒中的作用机理。方法选用线栓阻断大鼠大脑中动脉法复制脑缺血再灌注模型，采用荧光定量PCR方法测定脑组织PI3K、Akt和PTEN的表达，并通过免疫组化方法测定脑组织HIF-1α和VEGF的表达，考察通脉醒脑滴丸

2、对PI3K/Akt信号通路的作用。结果：通脉醒脑滴丸能上调脑组织PI3K、Akt、HIF-1α以及VEGF的表达，下调PTEN的表达。结论：研究初步证实通脉醒脑滴丸对脑缺血损伤具有保护作用，其机制可能与介导PI3K/Akt细胞存活通路的激活或上调有关。关键词：通脉醒脑滴丸，脑缺血，再灌注，PI3K/Akt，信号通路脑缺血卒中作为临床常见的危急重症，一直备受关注。对脑缺血的治疗核心在于对神经元损伤的保护以及溶栓再通。是否能在脑缺血卒中发生后，尽可能延缓细胞凋亡组织坏死的进程，减轻神经元的损伤，重新疏通血管或建

3、立有效的代偿循环，是考察药物对脑缺血保护作用的要点。本实验重点对中药复方制剂通脉醒脑滴丸防治脑缺血卒中的可能作用机制进行了探讨，以期为中医药防治脑缺血的作用机理研究提供新的思路。1材料与方法1.1试验药物受试药物：通脉醒脑滴丸，成都润华堂药业有限公司，批号：070530。规格：10mg/粒。用法用量：口服，每日88粒，分四次服用。主治缺血性中风引起的半身不遂、口眼歪斜、言语不利、偏身麻木等。阳性对照药物：尼莫地平片，山西亚宝药业集团股份有限公司，批号：070109。规格：20mg/片。用法用量：用于治疗缺血

4、性脑血管病，口服，每日30～120mg。1.2试剂引物合成及探针修饰：上海生物工程有限公司；Trizol，美国MRC公司；RevertAid™FirstStrandcDNASynthesisKit，立陶宛MBI公司；TaqDNA聚合酶、PCR反应缓冲液（10×）、MgCl2溶液（25mM）：购自北京博大泰克（BioDev）生物基因技术有限责任公司；dNTP：购自美国普洛麦格（Promega）公司；DNA分子量标准（DNAMarker：MarkerI，显示条带：100、200、300、400、500、600b

5、p，购自北京TIANGEN公司；琼脂糖（电泳级）：法国BIOWEST公司产品，上海Yito企业有限公司分装。；RabbitAnti-Hif-1alpha，北京博奥生物技术有限公司；VasculafEdothelialFactorMusoseAntiGM727302，基因有限公司；其它实验室常备试剂均为国产分析纯。1.3主要仪器FTC2000实时荧光定量基因扩增仪，加拿大枫岭（FUNGLYN）公司；PE9600DNA扩增仪，美国PE公司；MSEMicro-CentaurCentrifuge微型台式离心机，日本

6、Sanyo公司；水-1-http://www.paper.edu.cn平电泳仪，美国BIO-RAD公司；GelDoc1000凝胶成像系统，美国BIO-RAD公司。leicarm2135石蜡切片机，德国；Olympus-BX40型光学显微镜，日本Olympus公司；MIAS2000型计算机图像工作系统，电子科大金盘多媒体科技有限公司。其它实验室常备器皿、耗材均为国产优质品。1.4动物SD大鼠，SPF级，体重300±20g，雌雄各半，由四川省医学科学院实验动物研究所提供。合格证号：合格证号：SCXK（川）200

7、4－15。1.5方法1.5.1实时荧光定量PCR法检测线栓法致局灶性脑缺血再灌注大鼠模型PTEN、PI3K以及Akt的mRNA水平选取健康SD大鼠36只，雌雄各半，随机将大鼠分为9组：模型1h组，模型24h组，模型48h组；给药1h组，给药24h组，给药48h组；假手术1h组，假手术24h组，假手术48h组，每组4只。其中给药组三组均给予通脉醒脑滴丸73.85mg/kg。其余六组给予等体积蒸馏水。灌胃给药，每日一次，连续7天。于第7天给药1h后，假手术组三组大鼠仅在麻醉状态下分离右侧颈总动脉，不予阻断血流。

8、模型组三组和给药组三组参照下述方法，复制线栓法致大鼠脑缺血再灌注模型。[1～3]参照文献方法，第7天给药1h后，腹腔注射10％水合氯醛3.5ml/kg（350mg/kg）将大鼠麻醉，分离右侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA），在距CCA分叉部4mm处剪一小口，将拴线插入到ICA，实现对大脑中动脉（MCA）的阻断。固定线栓。逐层缝合切口并消毒。MCA阻断2小时后，拔出线栓，进行再灌注。假手术