斑节对虾miR-7562介导下ATG5-ATG12共轭系统应答哈维弧菌胁迫的作用机制研究.pdf

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1、学校代码：10264研究生学号：M150150294上海海洋大学硕士学位论文斑节对虾miR-7562介导下题目：ATG5-ATG12共轭系统应答哈维弧菌胁迫的作用机制研究MechanismofmiR-7562mediatedATG5-ATG12英文题目：conjugationsysteminresponsetoVibrioharveyistressinPenaeusmonodon专业：渔业研究方向：海洋生物功能基因姓名：刘伟指导教师：邱丽华研究员二O一八年五月上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我

2、恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位

3、论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本版权书。本学位论文属于不保密□学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月上海海洋大学硕士学位论文斑节对虾miR-7562介导下ATG5-ATG12共轭系统应答哈维弧菌胁迫的作用机制研究摘要斑节对虾(Penaeusmonodon)具有味道鲜美、营养丰富、成长快等特点，目前为东南亚海域及中国南海海域重要养殖经济水产种类。但近年来由于海洋环境污染日趋严重，水体微生物等物质经常严

4、重超标，致使斑节对虾的养殖产业发展因此受到严重影响。其中哈维弧菌是一种广泛存在于海洋环境中可以感染甲壳类、鱼类、贝类的条件致病菌，易引发突眼、慢性皮肤溃疡、败血症等动物病症，而细胞自噬可吞噬细菌或者病毒，对细胞免疫有重要的意义。在细菌与宿主互作中基因表达调控起非常重要的作用，miRNA是调控基因表达的重要因子，故研究miRNA调控细胞自噬基因在哈维弧菌刺激下的作用就很有意义。本实验利用已构建的斑节对虾转录组数据库筛选出ATG5和ATG12EST序列，用primer软件设计特异性引物，PCR进行ORF验证，

5、利用RACE技术扩增得到ATG5和ATG12基因的3’末端，以此得到两个基因的全长。确定了斑节对虾ATG5和ATG12基因在不同组织中的表达分布规律；对靶向调控ATG5和ATG12的miRNA进行了筛选，并利用双荧光素报告实验进行了验证；利用荧光定量PCR的方法及westernblot免疫印迹等方法对ATG5、ATG12与miR-7562在哈维弧菌应激下的表达调控关系进行了研究，并初步对由哈维弧菌应激所产生的细胞自噬、miR-7562及ATG5-ATG12共轭系统之间关联情况进行了鉴定，具体研究结果如下：

6、（1）PmATG5基因序列cDNA主要为5’-UTR包含114bp、1357bp3’-UTR和一个编码269个氨基酸的810bp开放阅读框。PmATG5分子量为31.125kDa，其理论等电点为5.66。PmATG12基因序列cDNA全长1101bp，包含363bp的ORF,16bp的5’-UTR和722bp的3’-UTR。开放阅读框编码120个氨基酸，分子量为13.59kDa，理论等电点为6.12。PmATG5和PmATG12在斑节对虾各个组织中均有表达，在肌肉组织中表达量最高，且两者的表达模式有一定的

7、相似性。序列比对结果显示，PmATG5氨基酸序列与蓝蟹的ATG5一致性高达87%，PmATG12的序列则与家蚕有较高的一致性。表明两者在进化上都高度保守，ATG5和ATG12对机体有十分重要的作用。I上海海洋大学硕士学位论文（2）miRNA的筛选：靶基因预测使用的为mireap，miranda，targetscan三个软件，miRNA靶基因预测的结果是取三个软件的交集。从本实验室已有的小RNA文库筛选调控ATG5和ATG12的miRNA，共有22种miRNA调控ATG5，有24种miRNA调控ATG12，

8、共同调控PmATG5和PmATG12基因的有三种，分别是mir-7562，mir-8485，mir-278。当斑节对虾受到哈维弧菌刺激时，miR-278和miR-7562在6h和24h均有明显的下调，PmATG5的相对表达量在72h达到最高，约为对照组的3.8倍，而PmATG12的相对表达量在哈维弧菌应激72h时达到最高，约为对照组的1.6倍，miRNA的表达与PmATG5和PmATG12表达呈负相关。双荧光素报告结果显示：m