PCR及等温环介导扩增技术在哈维氏弧菌上的应用【开题报告】

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1、毕业论文开题报告生物工程PCR及等温环介导扩增技术在哈维氏弧菌上的应用1．课题研究意义及国内外研究现状课题研究意义：自上世纪八十年代以来，我国海水养殖业发展迅速，走过了藻、虾、贝、鱼的开发历程，形成了“四次浪潮”，使我国一跃而成为世界上第一个养殖产量超过捕捞产量的国家。然而，随着工厂化高密度养殖的发展，各种病害相继发生。其中，弧菌性病害是最重要的病害之一，已成为海水养殖业持续发展的一大障碍。动物，如虾类、贝类和鱼类等。哈维氏弧菌病曾在我国养殖的中国对虾、南美白对虾、长毛对虾及日本对虾中大规模暴发。哈维氏弧菌也是多种鱼类的重要病原菌，其中包括在我国具有重要经济价值的

2、海水养殖鱼类，如牙鲆、大菱鲆、鲈鱼、大黄鱼、黑鲷、青石斑鱼、斜带石斑鱼、舌鳎等。哈维氏弧菌不仅宿主范围广，而且其弧菌病的暴发给海水养殖业造成了巨大的经济损失。因此，对哈维氏弧菌进行深入的研究，对于我国水产养殖业的健康发展具有重要的战略意义。哈维氏弧菌是水产养殖动物的重要致病菌，能够感染多种无脊椎动物和脊椎对于哈维氏弧菌病的防治，目前使用的仍是以抗生素为代表的化学疗法。抗生素类药物的应用，破坏了养殖环境中土著细菌的多样性，导致抗药性病原菌增加。抗生素的使用还引起药物残留，对食用者造成危害。寻找对环境友好的防治哈维氏弧菌病害的方法，是我国水产养殖业可持续发展的迫切要求

3、。在可预见的未来，哈维氏弧菌病害防治的主要思路有两条：一是提高水产养殖动物本身的抗病能力，包括发展免疫防治技术及培育抗病鱼种；二是研制对环境无害的绿色生物渔药。显然，这两种思路都离不开对哈维氏弧菌致病机理的深入理解。因此，对哈维氏弧菌致病因子的作用机理进行深入研究，具有十分重要的理论和实践意义。国内外研究现状：哈维氏弧菌是一种革兰氏阴性、发光的(并非所有菌株)需盐海洋细菌，菌体呈弧状，极生单鞭毛。哈维氏弧菌首次被Johnson和Shunk(1936)描述为哈维氏无色杆菌，主要是为了纪念E．N．Harvey在发光现象的系统研究方面所做出的突出贡献。多年以来，它也曾被

4、命名为哈维氏发光杆菌和哈维氏贝内克氏菌。随后，Baumann等于l980年将其命名为哈维氏弧菌，并沿用至今。哈维氏弧菌广泛分布于近岸温暖的海洋环境，如海水、海洋沉积物、海洋动物的体表、海洋发光鱼类和头足类动物等各种海洋场所，也是许多海洋脊椎动物和无脊椎动物的正常菌群。哈维氏弧菌是发光性弧菌病的主要病原，能够感染多种海洋脊椎动物和无脊椎动物。在泰国、印度、澳大利亚、厄瓜多尔、委内瑞拉及中国(包括台湾)等国家和地区，哈维氏弧菌曾被报道是养殖对虾的主要病原菌。在这些国家和地区，发光性弧菌病是养殖对虾最主要的病害。这种疾病名称是由哈维氏弧菌呈高密度生长时的发光现象而得名，

5、它主要感染苗期动物及动物的幼体，症状表现为动物体变得不透明、运动性减弱、发光和死亡等。哈维氏弧菌同时也是鱼类的病原菌，发病的症状和病理随着患病鱼的种类及身体状况不同而有所差别，但其典型症状为角膜不透明和眼球突出。已报道的患病鱼种主要有鲈鱼、养殖黑棘鬣鱼、棕色斑点石斑鱼、遮目鱼、大西洋棘白鲳、银色鲻鱼和短翻车鱼等。目前，哈维氏弧菌的基因序列检测主要除了传统的PCR检测技术外，还有更加严谨简便的等温环介导扩增技术（Lamp）快速检测。2．课题研究的主要内容、预期目标和研究方案主要内容：本研究先用传统的PCR技术快速检测获得测出的ToxR基因序列，再将环介导等温扩增技术

6、应用于哈维氏弧菌的快速检测，建立了一种针对哈维氏弧菌中的ToxR基因(t／h)的LAMP检测方法，并将两种方法进行比较分析。预期目标：（1）.制备培养基，选取获得单克隆菌株后活化培养；（2）.用试剂盒提取菌的DNA进行PCR电泳，并获得ToxR基因序列；（3）.根据序列设计目标引物，进行Lamp快速检测；（4）.整理数据，完成毕业论文。研究方案：对克隆的哈维氏弧菌的全长toxR基因及进行相关的序列分析。根据查得的几种弧菌toxR基因两翼核苷酸序列，设计和合成上下游简并引物，以哈维氏弧菌菌株的基因组DNA为模板进行PCR扩增，将获得一定的扩增片断进行克隆、鉴定和测序

7、。首次获得哈维氏弧菌约400bptoxR基因全长核苷酸序列。与其它弧菌的相应序列分析比对显示，该序列与霍乱弧菌的toxR基因有极大的相似性，与鳗弧菌的toxR基因也有较高的相似性，与副溶血弧菌的toxR基因的相似性一般。toxR基因全长核苷酸序列的获得将为拟态弧菌的菌种鉴定增添新的分子靶标，有助于其结构和功能的研究及通过突变分析鉴定出新的受toxR基因调控的致病基因。1）病原菌株、质粒和表达菌株2）分子生物学试剂，哈维氏弧菌总DNA的提取3）PCR反应体系和程序单次和同步PCR反应产物的检测4）重组蛋白的表达和纯化，并得到序列LAMP技术依赖于能够识别靶DNA上6

8、个特定区域