蛇床子素(osthole)对肝细胞肝癌的抑制作用及其机制研究

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1、博士学位论文论文题目蛇床子素（osthole）对肝细胞肝癌的抑制作用及其机制研究张露蓉研究生姓名刘海燕指导教师姓名免疫学专业名称肿瘤免疫研究方向2013年3月论文提交日期蛇床子素（osthole）对肝细胞肝癌的抑制作用及其机制研究中文摘要中文摘要第一章蛇床子素抗肝细胞肝癌作用的研究目的：研究蛇床子素抗肝癌作用及其特点。方法：采用MTT方法和流式细胞术观察蛇床子素对体外培养肝癌细胞株增殖、凋亡和周期的影响；应用SMMC-7721裸鼠肝癌模型和Hepa1-6C57小鼠肝癌模型观察蛇床子素在体的抗肝癌效应和毒性，及其在肝癌小鼠体内的吸收和分布研究。结果：1）蛇床子素对人肝癌细

2、胞SK-HEP-1、SMMC-7721和HepG-2，小鼠肝癌细胞Hepa1-6的增殖均有抑制作用，且有剂量和时间依赖关系；也可抑制正常肝细胞的增殖，但其IC50高于四株肝癌细胞，表现为其细胞毒性是有选择性的。2）蛇床子素可诱导人肝癌细胞SMMC-7721和小鼠肝癌细胞Hepa1-6的凋亡，对周期进程阻滞在G2期。3）蛇床子素可抑制裸鼠和C57小鼠肝癌模型的肿瘤生长，腹腔注射给药方式优于口服灌胃。4）蛇床子素可以进入肝癌小鼠血流较丰富的组织（包括肿瘤），其转运机制主要为简单的被动扩散。结论：蛇床子素是一种低毒、具有抗肝癌效应的天然化合物。第二章蛇床子素诱导肝细胞肝癌凋亡

3、机制的研究目的：阐明蛇床子素诱导肝癌细胞凋亡的机制。方法：应用Real-timePCR方法观察蛇床子素对凋亡相关84个基因表达的影响；采用westernblot和EMSA技术观察蛇床子素对Bax、Bcl-2、Caspase、PARP、CyclinB、NF-κB蛋白水平以及PI3K/Akt通路调节的影响；并采用MTT法观察蛇床子素与Trail联合用药对SMMC-7721肝癌细胞增殖的影响。结果：1）蛇床子素可以使28个凋亡相关因子表达升高，其中TNF受体（占21.43%）和TNF配体（占17.86%）家族所占比例最高。2）蛇床子素可以上调肝癌细胞中Bax蛋白的表达，下调B

4、cl-2蛋白的表达，使Bax/Bcl-2的比值增高；促进Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的活化，PARP蛋白酶的剪切；下调周期蛋白CyclinB1的表达。3）蛇床子素可抑制肝癌细胞中NF-κB的活化，有时间和剂量依赖性。4）蛇床子素对肝癌细胞中总Akt表达无影I中文摘要蛇床子素（osthole）对肝细胞肝癌的抑制作用及其机制研究响，可下调磷酸化Akt和PI3K二个亚基（p110和p85）蛋白的表达。胰岛素可以减弱蛇床子素对磷酸化Akt和PI3Kp110亚基蛋白表达的下调，而LY294002可增强其下调作用。5）蛇床子素可增强TRAIL对SMMC

5、-7721肝癌细胞增殖的抑制，但随着蛇床子素浓度的增加，其增强作用逐渐减弱。结论：蛇床子素诱导凋亡的机制是多靶点和多通路；可能作用于与TRAIL相同的靶点，其机制为通过抑制PI3K/Akt通路的激活，从而抑制NF-κB的活化，下调周期蛋白CyclinB，阻滞细胞在G2/M期；同时可以上调Bax蛋白表达，激活Caspase-9；并通过死亡结构受体激活Caspase-8，继而激活Caspase-3，促进PARP的剪切，从而诱导肝癌细胞凋亡。第三章蛇床子素对抗肿瘤免疫功能的增强效应目的：研究蛇床子素对肝癌小鼠免疫系统的影响，进一步从免疫增强角度探讨蛇床子素抗肝癌的作用机制。方

6、法：采用MTT法观察蛇床子素对体外培养脾淋巴细胞增殖的影响；应用Hepa1-6C57小鼠肝癌模型，采用流式细胞术测定小鼠脾脏中各淋巴细胞亚群和ELISA法测定血清中IL-2、TNF-α水平，观察蛇床子素对小鼠抗肝癌免疫反应的影响。结果：1）低浓度的蛇床子素可以促进未刺激和ConA、LPS刺激下小鼠脾淋巴细胞的增殖。2）蛇床子素对肝癌小鼠的胸腺重量和胸腺指数无影响，对脾脏重量和脾脏指数有增高趋势。3）蛇床子素对肝癌小鼠脾脏中B++细胞的比例和数量，及其活化和成熟均无影响；有升高巨噬细胞、CD4T和CD8T++细胞的比例和数量的趋势，对CD4/CD8比值保持在正常水平，并可

7、提高肿瘤组+++织中CD4T和CD8T细胞的比例。4）蛇床子素可以促进肝癌小鼠脾脏中CD4T++和CD8T细胞的活化，提高CD8效应型T细胞的比例。5）蛇床子素可降低肝癌+++小鼠脾脏中CD4CD25Foxp3调节性T细胞的比例。6）蛇床子素可以增高肝癌小鼠血清中IL-2和TNF-α水平。结论：蛇床子素具有增强肝癌小鼠抗肿瘤免疫反应的作用关键词：蛇床子素；肝细胞肝癌；抗肿瘤；凋亡；免疫功能作者：张露蓉指导老师：刘海燕IITheanti-tumoreffectsandmechanismsofOstholeinHepatocellularCa