mrna结构靶点筛选新方法rass的研究

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1、辨I。学似绝正沦文摘要mRNA结构靶点筛选新方法RASS的研究(摘要)学位申请人姓名：毛建平申请学科门类和级别：理学博士指导教师：毛秉智研究员专业名称：放射医学年级：2002级培养单位：军事医学科学院放射医学研究所学号：022032专业代码：100104尽管反义核酸、Ribozyme、DNAenzyme以及双链RNA干涉小分子-与mRNA分子在一级结构上严格按Watson．Crick碱基匹配原则互补配对发挥作用，然而能有效结合发挥作用的却是那些接近mRNA分子高度折叠结构的“靶点”的反义序列。本工作的主要目标是建立mRNA靶点的筛选方法，运用反义

2、设计技术进行基因治疗和基因功能研究。首先，采用单链寡核苷酸随机序列文库，首次应用3’末端固定方法使mRNA在液相中的自然状态下与其进行杂交，通过洗脱、筛选，获得mRNA的结合文库序列，阐明mRNA全部结构靶点，建立了一种新的mRNA靶点筛选的分子生物学方法RASS(RNAaccessiblesitesscreening)。其次，用RAss方法和文献报道ffoMAST(mRNAaccessiblesitestagging)技术同时对模型基因一绿色荧光蛋白GFP的mRNA进行了靶点筛选，应用RASS获得GFPmRNA上3个结合靶点1，2,4，采用MA

3、ST方法获得了l，2，3和4等4个靶点，其中1、2、4与RASS的3个靶点完全相同。体外，4个靶点中l、2、4号靶点的反义核酸有效，2和4号的结合效果最好：细胞内1、2、4号的反义核酸明显而特异抑制了荧光蛋白表达，2号反义核酸突变2个碱基的对照组在体外体内均丧失了作用效果。对2号靶点设计了向5’和向3’移位的多条反义核酸(分别错位4个和8个碱基的反义核酸A2—8、A2-4、A2+4、A2+8)，实验表明，只有2号靶点反义核酸的作用效果最好，据RASS所没计合成的反义核酸序列准确，是最佳设计的反义核酸序列。10-23DNAenzyme的体内体外作用

4、活性和反义核酸组完全相同，四个靶点的2和4号靶点的10-23DNAenzyme切割效果最好，1号其次，3号效果不佳。细胞内抑制效果与之相同。10-23DNAenzyme的体外体内作用活性正确反映了反义核酸结合有效性，提出：10-23DNAenzyme可以作为体外评价mRNA结构靶点的工具。论史摘甚设计10—23DNAenzyme对照组时，如果突变错配的碱基位于切割位置的左右碱基使l0-23DNAenzyme'突!t不结合能力降低，体外丧失了对mRNA的降解能力．但在细胞内仍抑制GFP基因表达，10．23DNAenzyme结合臂序列发挥了反义核酸作

5、用。10—23DNAenzyme对照组突变t0—23DNAenzymeN个结合臂中间碱基，使10-23DNAenzyme保留廷环结合能力、降低两臂结合能力，则丧失了对mRNA的降解能力，细胞内也丧失了抑制GFP基因表达。10-23DNAenzyme自身具切割mRNA的活性，用实验证明了10—23DNAenzymeff=j侧翼结合臂序列与RNA互i补结合以后能发挥诱RNaseH酶促降解mRaNA作用，认为10-23DNAenzvme能产生比反以核酸更理想的基因抑制效果。证明DNAenzyme在细胞内具有双重活性，比反义核酸有更好的应用潜力。第三，将

6、RASS方法和MAST方法、计算机软件RNAstructure3．71模拟方法对GFP的靶点，MAST方法和RNAstructure3．71模拟方法对小k1．Fas基因，兔D．globin墓IN片段的靶点进行了比较。RNAstructure371模拟长度较短的基因靶点正确。据MAST技术获得的兔(Oryctolaguscuniculus)[3一globin基因mI矾A(属于122nt的小基因片段)的靶点2个，和计算机软件RNAstructure3．71模拟分析的位点，也和寡核苷酸微阵列杂交技术筛选获得的靶点结果(NatalieM，1997)完全一

7、致。己经证明绿色荧光蛋白(GFP)mRNA4个结构靶点中2，4号是高效结合靶点，MAST技术获得了4号，但是它把2号靶点当作了低频率、低效靶点从而忽略了2号靶点，得到了3号无效靶点；PASS得到的靶点均有效，可能因为RNA“随机”标记技术导致了MAST对有效靶点的忽视；而RASS采用末端标记，能够获得全部有效靶点。RNAstructure3．71软件分析的靶点与GFP的4个靶点中有3个相同，约有50％一一60％能被预测得到。MAST筛选了1．5kb／j＼鼠Fas基因24-靶点(t，2)，只有一个最有可能被RNAstructure软件预测分析得到(

8、靶点2)，尚有许多其它可能的靶点。软件分析模拟推荐的结构靶点较多，随着基因长度增加计算机软件分析确认靶点的难度增大，预测的靶点需要实验验