日本血吸虫scp%2ftaps蛋白克隆表达和生物学功能初步的研究

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1、日本血吸虫scP厂rAPs蛋白的克降表达和生物学功能秽』步研究,4'tiI大学博士学位论文⑧日本血吸虫SCP／TAPS蛋白的克隆表达和生物学功能初步研究专业：病原生物学博士研究生：陈静芳导师：余新炳教授中文摘要血吸虫病是一种分布广泛，危害严重的人兽共患病。目前，WHO估计全世界有约74个国家和地区流行该病，约2亿人受感染，每年死于血吸虫病的人数达百万之多，血吸虫病至今仍是亟待解决的严重的公共卫生问题。目前，血吸虫病的防治措施主要是在易感地区进行大规模的化疗、灭螺和健康教育。化疗虽然可暂时降低发病率，但不能抑制再感染的发生，也不能阻止感染的传播，况且已经发现某些血吸虫株对化疗药物如吡喹

2、酮产生抗性。为弥补药物治疗的不足，WHO／TDR将血吸虫病疫苗的研究列为优先发展的项目之一而予以重点支持。随着日本血吸虫基因组测序的完成，对其不同发育阶段基因和蛋白表达动态变化的了解，将有助于探索血吸虫生长发育机制，寻找与其生长发育相关的关键的酶、功能蛋白或基因，为研制有效的阻断传播疫苗和新药开发提供科学指导。本课题由：1．国家“973计划”项目“我国重要食源性寄生虫病的发病机制及防治研究”(20loCB530000)基金资助2．国家重大科技专项“重要寄生虫病检测与监测”(2008zxl004-011)基金资助3．国家863课题“广州管圆线虫病和华支睾吸虫病关键防治技术的研究”(20

3、06AA022422)基金资助日本血吸虫scP厂rAPs蛋白的克隆表达和生物学功能初步研究中山大学博士学位论文③在我们通过日本血吸虫EST数据库寻找与生长发育有关的基因时，我们发现一感兴趣的基因家族——SCP／Tpx．I／A95／Pr-I／Se7(SCP／TAPS)蛋白家族。几乎所有真核生物都含有SCP／TAPS蛋白，这些蛋白的共同特点是都具有SCP保守结构域。目前，SCP保守结构域的确切功能还不是很清楚，但研究发现不同生物中SCP／TAPS蛋白发挥着不同的生物学作用，如调节免疫应答、性发育成熟、潜在的疫苗候选分子等。目前，许多吸虫、线虫中都有ScPfrAPS蛋白的研究报道，但对日本

4、血吸虫SCP／TAPS蛋白还没进行详细的分析和研究，因此我们通过生物信息学工具对日本血吸虫这一蛋自家族进行分析，并挑选出感兴趣的蛋白作为进一步研究的对象。研究目的和意义通过NCBI上公共数据库检索出日本血吸虫SCP／TAPS蛋白，序列同源比对、分子进化树分析等生物信息学工具对它们进行详细的分析，找到它们之间的异同点。从中挑选出感兴趣的基因进行深入的研究，初步探讨它们在日本血吸虫生活史的完成过程中所发挥的生物学作用。研究方法1．日本血吸虫SCP／TAPS蛋白生物信息学分析以黄蜂毒液抗原5为检索源，通过tBLASTx检索日本血吸虫基因组数据库，检索出同源的EST序列。利用生物信息学软件对

5、各序列的结构域、信号肽进行分析，多序列同源比对和分子进化树分析其进化规律，从中挑选出SfSCPI、SjSCP2作为进一步研究的对象。2．SjSCPI、SfSCP2的克隆表达和蛋白纯化根据sjscPl、驴CP2的eDNA序列PCR扩增出相应的片段，并克隆到原核表达载体pET-28a(+)中，大肠杆菌中诱导表达，亲和层析纯化目的蛋白。3．SjSCPI、SjSCP2阶段性表达研究RT-PCR检测SjSCPl、SjSCP2在雌虫、雄虫、虫卵和尾蚴各阶段转录水平的不同。rSjSCPI、rSjK3CP2免疫小鼠得到特异性抗体，制备各阶段虫体粗抗原，Westem-blottiiig分析sjscPi

6、、sjsca2在各阶段蛋白表达水平的不同。H只本血吸虫scP厂rAPs蛋白的克隆表达和生物学功能初步研究中IIl大学博士学位论文◎4．sjscP!的组织学定位以rSjSCPl抗血清为一抗，对日本血吸虫感染的兔肝脏石蜡切片以及尾蚴进行SjSCPI的组织学定位分析。5．感染BALB／c小鼠SjSCPI、SfSCP2特异性抗体分析尾蚴攻击感染BALB／c小鼠，分别于感染前和感染后取血，每周1次，连续12周，ELISA检测小鼠血清中抗原特异性总lgG、IgGl、IgG2a抗体的动态变化。6．rSjSCPi、rSjSCP2特异性抗体对小鼠日本血吸虫感染的影响rSjSCPi、rSjSCP2免疫B

7、ALB／c小鼠，每2周一次，共三次，末次免疫后2周经皮肤感染日本血吸虫尾蚴，同时设置PBS对照组。感染后42天处死小鼠，计数成虫回收数、每克肝虫卵数，计算减虫率和减卵率。rSjSCPl另设一组攻击感染后2周再行蛋白免疫，方法同前但只加强免疫一次。取小鼠肝脏石蜡包埋后做病理切片并HE染色，测量单个虫卵肉芽肿直径，观察rSjSCP!、rSjSCP2特异性抗体对虫卵肉芽肿的影响。ELISA检测每次免疫后及攻击感染后2周、4周、6周血清中抗原特异性总lgG、lgG