日本血吸虫高迁移率族蛋白(sjhmgb1)免疫生物学功能的初步研究

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1、学校代码：10270中图分类号：Q95学号112200913文献标识码：A上够脚范大誓硕士学位论文论文题目日本血吸虫高迁移率族蛋白(SjHMGBl)免疫生物学功能的初步研究学专院生命与环境科学学院业动物学研究方向动物生物技术研究生姓名刘群指导老师冯新港研究员完成日期2014年5月IIlllUl

2、lIWMIIIIIY2526360SchoolCode：10270StudentNumber：112200913CLC：Q95Documentcode：AShanghaiNormalUniversityMasterThesisAPr

3、eliminaryStudyonImmunologicalFunctionsandCharacterizationofSchistosomaJaponicumHighMobilityGroupBox1(SjHMGBl)ProteinDepartmentMajorSpecialtyNameAdvisorDateCollegeofLifeandEnvironmentScienceZoologyZoologicalbiotechnologyQunLiuXin—gangFengMay,2014论文题目：学科专业：学位申请人：指导老

4、师：日本血吸虫高迁移率族蛋白BI(SjHMGBl)免疫生物学功能的初步研究动物学刘群冯新港研究员摘要日本血吸虫病是一种危害严重的人畜共患疾病，对人类健康和社会经济发展存在不利影响。高效、安全的抗血吸虫病疫苗的研制是实现控制、消灭血吸虫病的有效途径。辐照致弱血吸虫尾蚴和童虫疫苗(RAV)能诱导宿主产生高保护性效应，但不适于直接应用，所以通过模拟RAV诱导的高保护性效应机制研发安全可靠的疫苗可能是解决血防难题的策略之一，而RAV免疫原性分子和细胞基础及机制的研究是探索RAV高保护性效应机制的切入点之一。RAV免疫可诱导宿主产生

5、以Thl为优势免疫应答的抗攻击感染效果，而正常尾蚴则不能诱导这种保护性效应。宿主对RAV的应答模式可能与虫体特征性抗原表达及宿主特征性的先天和获得性免疫应答相关。高迁移率族蛋白B1(HMGBl)是一种保守的内源性核内蛋白，在受到某些刺激后，HMGBl分子可以转到细胞外发挥生物学作用。多项研究表明，HMGBl与宿主感染性免疫反应有关，可以介导宿主树突状细胞(DCs)成熟和诱导T细胞向Thl型极化。因此，我们推测在RAV模型中，虫体细胞的凋亡坏死及虫源性HMGBl应急分子等在诱导高保护性效应方面发挥了关键作用。因此，本研究初步

6、比较了SjHMGBl在正常日本血吸虫不同发育阶段虫体内的分布情况；对SjHMGBl活化小鼠DCs成熟的免疫原性特征进行了初步研究：初步分析了体外培养不同发育阶段的童虫的凋亡和坏死情况，为进一步阐述SjHMGBl在RAV中的免疫生物学功能和机制奠定基础。首先，运用常规分子克隆技术，将目的片段SjHMGBl插入到pET28a(+)，并在原核表达系统中成功表达重组蛋白。利用重组蛋白免疫BALB／c小鼠制得免疫原性良好的多克隆SjHMGBl抗血清，运用免疫组织化学方法，观察SjHMGBl在不同发育阶段的虫体组织中的定位，发现在7d

7、、10d、14d、23d、32d和42d中均有分布，初步推断其在童虫及雄性成虫的睾丸中表达量略高。采用Bac—to—Bac杆状病毒昆虫细胞表达系统制各无内毒素(LPS)干扰的SjHMGBl蛋白。间接免疫荧光法检测转染重组穿梭质粒的昆虫细胞(st9)，将纯化蛋白进行WesternBlot分析其免疫原性，并进一步利用TOP．TOP方法进行蛋白质谱分析。结果表明我们成功在sf9细胞中表达了sjHMGBl蛋白，且具有良好的免疫原性。为验证SjHMGBl是否能够活化宿主树突状细胞(DCs)，参与宿主免疫炎症反应，制备无菌小鼠骨髓来源

8、的树突状细胞(BMDCs)，与真核表达的SjHMGBl纯化蛋白共孵育，流式细胞术(FCM)测DCs表面标志CD40、CD80、CD86和MHCII的表达量，分析DCs的表型成熟情况。结果表明，DCs表面的CD40、CD80、CD86和MHcII均呈上调表达，初步表明SjHMGBl可以促进BMDCs的表型成熟，为后续的功能成熟实验奠定基础。为了解RAV诱导宿主高保护力与血吸虫虫体细胞凋亡坏死的关系，我们对不同时期的正常和RA尾蚴体外转化童虫的凋亡坏死情况进行了初步分析。分别收集RA与正常尾蚴，体外机械断尾转化为童虫，体外分别

9、培养4d、7d、10d和14d，分别运用透射电镜(TEM)和流式细胞术(FCM)观察虫体超微形态变化及检测虫体细胞的凋亡情况。TEM结果显示，正常组和辐照组间虫体形态早期(4d)未呈现明显差异变化；经7d至14d时正常虫体呈现逐渐凋亡坏死的表型变化，而辐照组虫体则呈现出更加明显的坏死表型变化。FCM结果