神经酰胺对高糖培养的人脐静脉内皮细胞pkbenos信号通路的影响及机制研究

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1、中图分类号UDCR587．2610博士学位论文学校代码10533密级公五神经酰胺对高糖培养的人脐静脉内皮细胞PKB／eNOS信号通路的影响及机制研究Effectsofceramideonhighglucose-inducedderegulationofPKB／eNOSsignalingpathwayinhumanumbilicalvascularendothelialcells作者姓名：王爱民学科专业：临床医学研究方向：内科学学院(系、所)：湘雅医院指导老师：雷闽湘教授论文答辩日期幽腹J、岁。答辩委员会主席中南

2、大学2013年5月原创性声明llllIllIIIIIIlllllllIlllllllllIIIY2424878本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：曼篁墅学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根

3、据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。作者签名：堑导师签名盈匕日期：旦年』月竺日神经酰胺对高糖培养的人脐静脉内皮细胞PKB／eNOS信号通路的影响及机制研究摘要：目的：本研究旨在明确：1、观察高糖培养的血管内皮细胞神经酰胺及NO的浓度变化；2、神经酰胺是否与高糖引起的血管内皮细胞胰岛素IRS．1／

4、P13K／PKB(Akt)／eNOS信号通路的下调有关；3、抑制神经酰胺的合成能否改善高糖引起的／PKB／eNOS的活性降低以及内皮功能的紊乱；4、抑制神经酰胺降解是否加重血管内皮细胞PKB／eNOS信号通路抑制，使NO的合成减少。方法：1、实验分组：(1)低浓度(5mM)和高浓度(30mM)D．葡萄糖培养HUVECs4、8、12、16和24d'时对细胞内神经酰胺及NO浓度的影响；(2)不同浓度5、10、20、30mMD一葡萄糖培养HUVECs细胞16d,时后，细胞内神经酰胺及NO浓度的变化；(3)不同浓度(5

5、、10、20、30mS)D．葡萄糖培养的HUVECs细胞给予50nM胰岛素刺激后，测定细胞内NO浓度的变化；(4)30mMD．葡萄糖培养HLWECs细胞16d'时，测定内皮细胞上IRS．1、P13K、Akt、eNOS蛋白表达及Akt、eNOS磷酸化蛋白的变化；(5)分别给予神经酰胺合成途径的特异性抑制剂50#aMyriocin或2vMDES后，测定30raMD一葡萄糖培养的HUVECs细胞内神经酰胺浓度、Akt、eNOS蛋白表达及Akt、eNOS磷酸化蛋白的变化和NO的变化；(6)分别给予抑制神经酰胺降解途径的

6、特异性抑带iJ齐UlS0vMNOE或50vMPDMP后，测定30mMD．葡萄糖培养的HUVECs细胞内神经酰胺浓度、Akt、eNOS蛋白表达及Akt、eNOS磷酸化蛋白的变化和NO的变化；(7)给予30mMD．葡萄糖培养的HUVECs细胞50nM胰岛素刺激后，分别加入so#vlMyriocin、2vMDES、150vMNOE或50r心ctPDMP，测定细胞内神经酰胺浓度、Akt、eNOS蛋白表达及Akt、eNOS磷酸化蛋白的变化和NO的变化。2、方法：采用高浓度D．葡萄糖培养HUVECs；液相色谱．质谱联用法测

7、定细胞神经酰胺浓度；Westernblot法检测血管内皮细胞中IRS．1，P13K，Akt和e_NoS表达；重氮还原法测定NO合成。结果1．和低糖组相比，高糖组(30mMD．葡萄糖)培养的HUVECs内皮细胞内神经酰胺浓度随时间的延长呈逐渐增加的趋势，在16小时时神经酰胺浓度达最高值，NO浓度随时间延长呈逐渐递减的趋势，在24小时降低最明显；高糖组培养的HUVECs细胞内神经酰胺的浓度的升高和NO浓度减少具有时间依赖性(尸0．05)。2．与低糖组

8、相比较，10、20、30mMD一葡萄糖培养HUVECs细胞均能引起细胞内神经酰胺浓度的增加和NO水平的下降(p