jakstatnfκb通路介导高糖引起的人脐静脉内皮细胞的损伤与炎症反应

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1、硕士学位论文JAK．STAT／NF．rd3通路介导高糖引起的人脐静脉内皮细胞的损伤与炎症反应硕士研究生：廖静秋指导老师：吴文教授IIIIIIIIIrllMIllllIIIIIrllIIIIJY3116917摘要研究背景糖尿病(Diabetesmellitus，DM)是一组以高血糖为特征的代谢性疾病。近年来，随着社会发展，经济条件改善，人民生活水平提高，糖尿病患病率逐年上升。糖尿病血管病变(Diabeticangiopathy，DA)是糖尿病患者最常见的慢性并发症，也是糖尿病患者失明、截肢以及死亡的

2、主要原因之一，严重影响患者预后和生活质量。高血糖通过直接或间接的影响引起血管内皮功能异常，启动或加重糖尿病血管病变。过去关于高血糖损伤血管内皮细胞的机制主要集中于糖基化终末产物、多元醇通路、蛋白激酶C等，近年来，新的研究目光己逐渐转向内皮细胞损伤过程中的各种细胞信号转导通路。Janus激酶／信号转导子与转录激活子(Januskinasesignaltransducerandactivatoroftranscription，JAK／STAT)通路是细胞信号转导的重要通路之一。新近研究发现，JAK／S

3、TAT通路参与了糖尿病并发症的发生发展。MarreroMR等人发现，高糖在。肾小球滤过膜细胞通过激活JAK／STAT通路导致肾小球滤过膜细胞的增殖，从而引起糖尿病肾病。此外，有研究通过建立糖尿病大鼠模型，发现JAK／STAT信号转导通路的激活可能参与了糖尿病心肌病心肌纤维化的发生发展。而对于JAK／STAT通路是否参与高糖诱导血管内皮细胞的多种损伤，目前鲜有报道。万方数据摘要核因子．rd3(nuclearfactor-KB，NF．r,B)信号通路对炎症反应、免疫反应等具有重要调节作用。相关研究显示

4、高糖可通过激活NF．1cB通路促使内皮细胞炎症及免疫反应相关因子生成增多进而推进血管炎症的发生发展，而血管炎症正是糖尿病血管病变发生发展过程中一个重要的阶段。已有多项证据表明JAK／STAT信号通路与NF．r,B信号通路之间存在交互作用。DigicayliogluM等发现红细胞生成素(EPO)可通过NF．v,B信号通路介导神经保护作用，而这一过程可被JAK／STAT通路调节。那么，在血管内皮细胞中，JAK／STAT信号通路可否调节NF．rd3信号通路介导高糖诱导的血管内皮细胞炎症反应还有待进一步研

5、究探讨。为此，本文旨在探讨JAK／STAT通路在高糖诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)损伤过程中的作用以及在这一过程中JAK／STAT通路可否调节NF．r,B信号通路介导高糖诱导的血管内皮细胞炎症反应，为深入阐明高糖损伤血管内皮细胞的作用机制提供新颖的实验依据。研究方法1人脐静脉内皮细胞的体外培养细胞培养在含10％FBS的低糖DMEM培养基中，加入100U青霉素、100mg链霉素，置于37℃、含5％C02的培养箱中培养。待细胞融合达80％后，使用0．25％胰蛋白酶．EDTA进行消化，适度消化后加

6、入完全培养基终止胰蛋白酶的消化作用。将细胞吹落以形成细胞悬液。1200r／min离心5min，弃上清，按1：3传代。2实验分组实验分为6组：(1)t常对照(contr01)组；(2)高糖(highglucose，HG)损伤组；(3)AG490(JAK／STAT通路抑制剂)预处理+高糖损伤组；(4)AG490组；(5)PDTC(NF．r,B通路抑制剂)预处理+高糖损伤组；(6)PDTC组。3CCK．8实验测定细胞存活率将HUVECs接种在96孔培养板中，当细胞在培养孔内生长至大约80％时，II万方数

7、据硕士学位论文根据实验要求给予不同处理，于每孔加入10txLCCK．8溶液，37℃孵育2h，用酶标仪检测各孔吸光值，波长设定为450nm，并根据公式：细胞存活率(％)=处理组OD值／对照组OD值×100％，求得细胞存活率。4Westernblot法检测JAK2、STAT3、caspase．9、eNOS和NF．r,Bp65的表达将HUVECs接种于60mm培养皿中，细胞贴壁生长至80％时给予不同处理因素，弃培养液，用预冷的PBS冲洗2次，各皿加入80¨l裂解液后置于4℃裂解30min，12000r／

8、min离心15min，取上清液，蛋白浓度采用BCA法进行测定。总蛋白经SDS．PAGE分离后，转移到PVDF膜上。使用5％脱脂奶粉封闭90min后，弃封闭液，分别加入p-JAK2和JAK2(1：2000)，p-STAT3、STAT3和caspase-9(1：5000)，NF-r．Bp65、P-NF—r．Bp65、eNOS(1：1000)，4℃过夜，然后用TBST洗3次(每次10min)，加入II抗(1：10000)，室温孵育60min，再次用TBST洗3次(每次10min)。ECL