pi3kakt和mekerk通路调控h3k27me3甲基化酶和去甲基化酶基因表达的研究

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1、分类号：密级：公开学号：2009208008单位代码：10759石河子大学博士学位论文PI3K/AKT和MEK/ERK通路调控H3K27me3甲基化酶和去甲基化酶基因表达的研究学位申请人李晶指导教师刘守仁申请学位门类级别农学博士学科、专业名称动物遗传育种与繁殖研究方向动物遗传资源利用与绵羊育种所在学院动物科技学院中国·新疆·石河子2013年6月HistoneH3lysine27MethylaseandDemethylaseGenesExpressinonRegulatedbyPI3K/AKTandMEK-ERKpathwayShih

2、eziUniversityInFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofDoctorofAgricultureByLiJing(AnimalGeneticsandBreeding)DissertationSupervisor:Prof.LiuShouRenJune,2013Shihezi,Xinjiang,China中文摘要组蛋白甲基化是一种重要的表观遗传修饰，参与基因的表达调控。组蛋白H3K27me3是抑制基因转录的表观遗传修饰标记之一，可以抑制靶基因的转录。目前研究发现，组蛋白H3K27

3、me3受组蛋白甲基化酶和去甲基化酶的调控。其中，Zester同源增强子2是组蛋白H3K27甲基化转移酶，EZH1是它的同源物，它们都是Polycomb蛋白家族的成员。UTX和JMJD3是组蛋白H3K27me3去甲基化酶。PI3K/AKT信号通路对组蛋白甲基化酶EZH2基因表达已经有报道，但在成肌细胞分化过程中是否调控组蛋白H3K27甲基化酶和去甲基化酶的表达还不清楚，我们用小鼠成肌细胞C2C12为研究材料，采用免疫印迹、染色质免疫共沉淀（Chromatinimmunoprecipitation，CHIP)、定量PCR（Q-PCR）的

4、方法研究PI3K/AKT信号通路在成肌细胞分化阶段对组蛋白H3K27甲基化酶EZH1/EZH2和去甲基化酶UTX/JMJD3的表达调控。此外，在多种肿瘤组织中检测到EZH2存在过表达的现象，UTX和JMJD3也被检测到发生突变或者表达下降。MEK/ERK信号通路是生物体内广泛存在的一条信号通路，参与调控细胞的生长、增殖、分化和凋亡等生命过程。在某些癌症细胞中，MER/ERK信号通路参与调控EZH2基因的表达。为了进一步研究这条通路对组蛋白甲基化酶和去甲基化酶的调控。我们以C2C12、C127、NIH3T3、HEPA1-61-6、RD

5、五种细胞系为研究对象，用RT-PCR和Western-Bloting方法分析检测MER-ERK信号通路对组蛋白H3K27甲基化酶EZH2/EZH1基因和去甲基化酶UTX/JMJD3基因的表达。结果如下：磷酸化的AKT在成肌细胞分化过程中逐渐升高，EZH1和JMJD3蛋白表达变化不明显，EZH2蛋白表达降低，到第6和第7d蛋白降到最低值，UTX蛋白表达升高。成肌细胞分化过程中用PI3K/AkT信号通路激活剂处理24h后，Myogenin和MCK蛋白表达升高，H3K27me3在Myogenin基因启动子区和MCK基因启动子及增强子区的富

6、集与对照组相比降低。UTX蛋白表达略微升高，JMJD3、EZH1和EZH2蛋白与对照相比变化不明显。用PI3K/AKT号通路抑制剂处理24h后，Myogenin和MCK蛋白表达降低，H3K27me3在Myogenin基因启动子区和MCK基因启动子及增强子区的富集与对照组相比升高，UTX和EZH2蛋白表达均降低，其中JMJD3和EZH1蛋白表达降低不明显。不同浓度的MEK/ERK信号通路抑制剂U0126（0、10、20、40umol/L）处理24h后，在五种细胞磷酸化的ERK1/2表达水平随着浓度的升高逐渐降低；EZH1和EZH2基因

7、mRNA表达水平与对照相比有不同程度的降低，EZH1基因mRNA表达变化没有达到显著水平，EZH2mRNA在NIH3T3、C2C12、RD、HEPA1-6四种细胞表达变化达到显著水平(P<0.05)，EZH2蛋白表达在五种细胞系内都降低，其中C127细胞变化最不明显，HEPA1-6细胞变化最为显著。组蛋白H3K27me3去甲基化酶UTX基因在C2C12、C127、NIH3T3、HEPA1-6、RD五种细胞mRNA表达变化不明显，JMJD3基因mRNAI表达变化达到显著水平（P<0.05)，JMJD3蛋白表达普遍升高，但在RD细胞蛋白

8、表达升高不明显。对HEPA1-6细胞免疫荧光检测，EZH1和UTX蛋白在细胞质和细胞核内都有表达，EZH2蛋白在细胞核内表达比较强，JMJD3在细胞质内表达比较强。加入MEK/ERK信号通路抑制剂U0126处理细胞24h后，与对照相比