骨髓间充质干细胞移植促进大鼠损伤脊髓的功能恢复

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1、中国医科大学硕士学位论文骨髓间充质干细胞移植促进大鼠损伤脊髓的功能恢复姓名：刁延娜申请学位级别：硕士专业：发育生物学指导教师：庞希宁20050501中国医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：韭}日期：—窒壁址中国医科

2、大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时：署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容(保密内容除外)，以采用影印、缩印或其他手段保存论文。论文作者签名：指导教师签名：中文论著摘要骨髓间充质干细胞移植促进大鼠损伤脊髓的功能恢复目的既往认为中枢神经系统神经元一旦损伤不能再生，尤其是哺乳类

3、动物脊髓内的神经元缺乏再生能力。然而，上世纪80年代始，有研究表明移植外周神经和胎髓能促进脊髓损伤轴突的再生。以后，诸多实验显示了脊髓损伤后可能会再生。而骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemceHs，MSCs)因具有多向分化的潜能、在一定条件下可分化为神经元样细胞，且易于提取、分离等特点，已成为细胞替代治疗的新来源。有报道，将大鼠MSCs移植到脊髓挫裂伤的大鼠体内，显示了明显的功能恢复。研究者直接地或将大鼠MSCs与神经球细胞共培养后，通过局部点注射的方式移植进大鼠损伤的脊髓内，发现实验组大鼠的后肢运动功能比对照组恢复明显，形态学检测显示移植的MSCs位于损伤区中心

4、，且朝向损伤中心牵拉宿主组织，阻止脊髓空洞的形成。虽然诸多研究表明MSCs可部分修复损伤脊髓的解剖连接，但目前仍无充分结果说明MSCs能够恢复损伤脊髓的传导功能。为此，我们首先建立了大鼠脊髓半横断损伤模型，通过将MSCs移植到受损区，探讨MSCs在脊髓传导功能损伤修复中的作用，进一步探索MSCs替代治疗的可行性，为治疗中枢神经系统损伤提供理论依据。方法1、大鼠MSCs的分离培养和鉴定1．1在无菌条件下取Wistar大鼠股骨和胫骨骨髓细胞做原代培养。1．2根据细胞贴壁性能不同，筛选易贴壁但贴壁不牢的细胞进行传代培养。·l·1．3免疫细胞化学染色法鉴定MSCsCIM5和CD90的表

5、达情况。2、BraU(5’一溴脱氧尿苷)体外标记MSCs3、MSCs移植3．I制备大鼠脊髓左侧半横断损伤模型。3．2实验组12只：术后立即向损伤区远端注射MSCs，对照组12只：注射等量磷酸缓冲盐溶液。4、移植后鉴定4．1采用BBB评分系统评估大鼠行为学改变。4．2心脏灌流固定大鼠脊髓组织。4．3免疫组织化学染色法观察BrdU标记的MSCs在脊髓损伤处存活情况。4．4取材前48小时行辣根过氧化物酶(HRP)逆行示踪。4．5HRP示踪结果观察脊髓损伤处神经通路的重构建。4．6皮层体感诱发电位(CSEP)测定脊髓损伤处神经通路传导功能的恢复。4．7统计学分析。结果1、免疫细胞化学染

6、色检测传代培养的MSCs标志物表达：CD45(一)，CD90(+)。2、术后实验组大鼠后肢运动功能比对照组恢复明显，l周、2周、3周、4周，8周BBB评分均高于对照组。3、术后1周行石蜡切片，免疫组织化学染色结果显示在实验组大鼠脊髓损伤区远端检测到BrdU阳性细胞。4、术后2个月行冰冻切片，在实验组大鼠的损伤脊髓近端的腹侧角检测到HRP阳性细胞，而于对照组大鼠未检测到HRP阳性细胞。5、术后2个月行CSEP测定，实验组大鼠的CSEP波形恢复但波幅减低，潜时期延长，对照组大鼠未见CSEP产生。·2·结论l、通过损伤后立即局部注射的方式将MSCs移植进脊髓损伤区，MSCs可在损伤区

7、存活。2、存活的MSCs可分化为神经元，在损伤局部形成神经元通路，使损伤脊髓的远端和近端建立联系，从而促进：脊髓神经纤维传导功能恢复。也可能促进了损伤的神经细胞轴突的再生。关键词骨髓间充质干细胞；脊髓损伤；移植·3”r甄谣磊i⋯)Transplantationofbonemarrowmesench，‘malstemcellspromotefimctionalrecoveryoftheinjuredratsspinalcordPurposeItwaspreviouslyknownthatthe