新型仿生软骨组织工程用壳聚糖%2fⅱ型胶原支架构建及实验的研究

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1、中山大学博士学位论炙(2005)变德海耪型仿生软骨组织I程甩壳聚糖，ll型睦碌支架的构建厦实验研究中交摘要新型仿生软骨组织工程用壳聚糖／II型胶原支架的构建及实验研究专业外科学(骨外科学)博士研究生史德海导师蔡道章教授中LfI大学附属第三医院骨科摘要刨伤或退行性疾病引起的关节软骨全厚缺损是临床常见难题。软骨自身修复的能力十分有限，特别是当软骨缺损面积超过4cm以上时～般不能自行修复。现有的药物治疗或外科干预疗法常导致软骨缺损以力学性能差的纤维软骨样组织修复替代正常的生理性透明软骨组织，因而病变的关节不可避免地继续发展为骨关节炎。组织T程概念的引入为软骨组织功能性修复提供

2、了新的前景。种子细胞、支架材料、细胞一支架载体体外构建、细胞一载体复合物体内植入是组织T程的基本内涵，其中合适的细胞支架载体是组织_[程成功的关键因素。理想意义的组织工程支架应当仿生特定组织细胞外天然基质结构，以便能最大程度上支持组织再生。解剖上，软骨细胞外基质主要由糖氨多糖和Il型胶原两种有机成分构成。为此，我们设想，用糖氨多糖的类似物壳聚糖和lI型胶原复合制作而成的基质支架应当是一种理想的仿生软骨组织工程支架。围绕以上的课题背景，本研究首先探讨了组织工程用壳聚糖的制备，然后用制备的壳聚糖和高纯度的诸II型胶原复合、制作复合支架，并对复合支架的理化性能进行检测。采用体

3、外细胞支架共培养的方法评价支架的细胞相容性，使用兔耳皮下埋植实验考察支架在体内的生物降解眭。最后，应用支架埋植于兔膝关节软骨全厚缺损的动物模型观察其在软骨缺损修复中的作用，从而评估其应用于软骨组织工程的可能性。中出大学博士学位论文(2005)变德海新型仿生软苛组织I程用壳聚糖，H型腔啄支桨的{匀建占乏宴验研究中文摘要1．组织工程用壳聚糖的优化制备材料与方法保持氢氧化钠溶液浓度50％不变、反应温度105。C、反应时间145小时不等，分别采用连续反应不换碱，每小时问歇换碱，及每小时间歇换碱加水洗的3种不同方法用甲壳素制备壳聚糖。测定所制备的不同壳聚糖制品的脱乙酰度、黏度、及

4、稀酸溶解性能。用冷冻干燥法将2％壳聚糖溶液制成三维多孔支架，力学测试机测定支架抗拉伸强度。作为对照，实验制品与国内市售壳聚糖产品进行相关性能比较。结果所制备壳聚糖的脱乙酰度为66．1％～95．5％，粘度为2～240Pa·s不等。以延长反应时问、间歇更换碱液加水洗的方法(C组)制备出的壳聚糖脱乙酰度及粘度均较高，色泽明亮，酸溶解完全。采用冷冻干燥法制成的各组壳聚糖三维支架成形均良好。c组制备方法中，3小时点壳聚糖制品制成三维支架后，其抗拉伸力学强度较其他两组相同脱己酰度壳聚糖制品支架要高，并显示出比市售壳聚糖制品更为优越的性能。2．壳聚糖／n型胶原复合支架的制作及理化性能

5、检测材料与方法(1)88％脱乙酰度的壳聚糖溶于0．2mol／L醋酸溶液制成2％溶液，高纯度猪II型胶原溶于0，5mol／L醋酸溶液制成l％溶液，两者按4：l(重量比)充分搅拌混合、脱气。将混合物置于直径3．5cm的培养皿中，采用冷冻干燥法将其制作为三维固体支架。(2)梯度乙醇和0．1mol／LNa。HPO；溶液对支架进行中和，碳化二亚胺(EDC)／N一羟基琥珀酰亚胺(NHS)对支架进行交联。(3)改良无水酒精置换法测定支架的孔隙率；电子显微镜扫描支架表面结构：力学测试机测定支架的抗拉伸力学强度。(4)干燥支架浸入PBS中做吸水性能测定。重20mg干燥支架置于I．Omi含

6、有II中df大学博上学位论文(2005)史德海新型仿生软骨组织I程用壳聚糖，H型骏骧支禁的鞠建瑟实验研究中文摘要l×105单位溶菌酶的磷酸缓冲液(PBS)中，放入37。C水浴中降解消化，分别间隔2，4、6，8周时取出残余支架干燥称重后行体外降解率测定。结果(L)制备的三维壳聚糖／II型胶原复合支架直径3．4cm、厚0．4era，孔隙率为89．30％。(2)电镜扫描显示，复合支架的结构呈开放多孔的结构，内部孔洞高度相连，孔径大小范围在t00um～250pm之间。(3)交联后的支架拉伸力学性能增强，吸水性能增加达到895．70+_8．35％。(4)交联后的支架体外降解速度较

7、未交联的支架慢。3．复合支架一软骨细胞的体外培养及支架的兔耳皮下埋植实验材料与方法(1)取2周龄的新西兰白兔关节软骨，用0，25％的胰酶和O．2％11型胶原酶消化，获得软骨细胞。将软骨细胞放入含10％FBS的[NEⅣI培养液，置于37。C、5％C0：恒温培养箱内培养及传代培养。(2)取第三代培养的软骨细胞，按5×104／cm2的密度种植于消毒后的复合支架上。体外共培养15天后，取出共培养杨，分别用4％中性福尔马林和2．5％戊二醛溶液固定处理后行组织学、免疫组化、及电镜观察。(3)将消毒的复合支架埋植于兔耳背皮下，6周后将埋植物连同其周围组