新型真菌免疫调节蛋白的筛选及其生物活性的研究

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1、学校代码：10264研究生学号：M150250446上海海洋大学硕士学位论文新型真菌免疫调节蛋白的筛选及其生物活性的研题目：究Screeningoffungalimmunomodulatory英文题目：proteinanditsbiologicalactivity.专业：食品工程研究方向：生物制药姓名：白睿指导教师：鲍大鹏2018年4月4日上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果

2、的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本版权书。本学位论文属于不保密□学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月上海海洋大学硕士学位论文真菌免疫调节蛋白的筛选及其

3、生物活性的研究摘要真菌免疫调节蛋白（Fungalimmunomodulatoryprotein，FIP）是一种结构和功能与植物凝集素和免疫球蛋白重链可变区相似，具有凝集血红细胞、促进人外周血淋巴细胞增殖和刺激免疫细胞产生多种细胞因子等免疫调节活性的小分子蛋白质。由于其具有免疫活性高，有效浓度低，成分单一易于纯化等优势而拥有良好的临床应用前景和药用保健价值。虽然各种FIPs之间在一级结构、二级结构和高级结构上都具有一定的相似性，并具有相似的生物学功能。然而，不同的FIPs在某些生物活性方面表现也有所不同。因此，在真菌中挖掘新型FIPs，将为探索具有更多生物功能或更高免疫调节

4、活性的药用蛋白提供丰富的生物资源，并为其开发为一种新型药品或功能食品提供有价值的理论基础和应用依据。本文以灵芝免疫调节蛋白LZ-8为模板，在草菇（Volvariavolvacea）基因组中进行BLAST比对发现与LZ-8相似性在60%以上的7种FIP，除Fip-vvo为已报道的草菇免疫调节蛋白以外，其它6种FIP均为新型的真菌免疫调节蛋白，我们将其分别命名为FIP-vvo77，FIP-vvo78，FIP-vvo79，FIP-vvo80，FIP-vvo82，和Fip-vvo98。首先，通过生物信息学方法，将这些新型FIP与已知的真菌免疫调节蛋白在生理生化性质、亚细胞定位、信

5、号肽、遗传进化等方面进行比较分析，从而预测新型FIP的活性。然后，在体外构建工程菌，诱导表达新型FIPs及纯化，得到目的蛋白，检测新型FIP的免疫调节活性和促进细胞凋亡活性，并从分子水平研究新型FIP对Hela、A549和Spca-1细胞凋亡通路的影响，筛选出生物活性较好的FIP，为后续开发和应用研究提供重要的理论依据。具体结果如下所示：:1.7种新型真菌免疫调节蛋白均由约113个氨基酸残基组成，不含半胱氨酸（Cys），富含缬氨酸（Val）和络氨酸（Tyr）。相对分子质量为12-13kD，理论等电点pI从6.06到8.83。经过比较发现FIP-vvo82的不稳定系数（II

6、）最高（20.77），就此推测FIP-vvo82与其他新型FIPs相比，柔性较好，可能具有较高活性，并通过分子模拟方法预测FIP-vvo82产生高活性的分子机理。2.检测7种草菇免疫调节蛋白刺激免疫细胞分泌白介素-2，实验结果为新型真上海海洋大学硕士学位论文菌免疫调节蛋白FIP-vvo82的免疫活性最高，这与生物信息学分析结果相一致。3.检测了6种新型FIPs（FIP-vvo78、79、80、82、98以及FIP-vvo）对Hela、A549和Spca-1细胞活力和促凋亡的影响。结果表明，FIP-vvo82对Hela、A549和Spca-1细胞的促凋亡效果较为明显，其中对

7、Hela和A549细胞促凋亡效果最为明显，凋亡率分别为63.4%和54.8%，FIP-vvo-79、FIP-vvo-80和FIP-vvo-97对Spca-1细胞促凋亡效果较为显著，凋亡率分别为：73.4%、73%和71.3%。4.检测了6种新型FIPs（FIP-vvo78、79、80、82、98以及FIP-vvo）对Hela、A549和Spca-1细胞凋亡信号通路的影响。结果表明，7种新型FIPs通过阻碍线粒体膜电位（MMP）的生成，减少凋亡相关蛋白Bcl-2和Bcl-xl量，提高Caspase-3的活性，提高细胞色素C（Cy