绵羊卵母细胞孤雌激活与体细胞核移植

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1、西北农林科技大学硕士学位论文绵羊卵母细胞孤雌激活与体细胞核移植姓名：张晓建申请学位级别：硕士专业：发育生物学指导教师：张涌;陈静波20050601绵羊卵母细胞孤雌激活与体细胞核移植摘要哺乳动物体细胞核移植是一项复杂而有序的操作过程。本文从不同方面研究了绵羊卵母细胞的体外成熟、孤雌激活以及重构胚的构建过程，建立了一套比较稳定的核移植体系，其结果如下：1．分析了EGF不同添加量、FSH：LH的不同配比和不同大小卵泡的卵泡液对绵羊卵母细胞的体外成熟的影响。结果表明：(1)添加30ng／mlEGF显著高于其他试验组的成熟率(

2、85．0％VS60．O％，71．7％，72．7％，P<0．05)，并可提高绵羊孤雌激活胚的囊胚发育率；(2)成熟液中添加FSH1ug／ml，LH5．0IU／ml成熟率最高；(3)在绵羊卵母细胞成熟液中添加3％绵羊大卵泡液，在成熟率上极显著高于小卵泡液的20％添加组(78．6％VS36．5％，P

3、4h、26h的卵母细胞玻璃化冷冻、解冻后形态正常率差异不显著(P>O．05)，培养24h卵母细胞冷冻保存后，卵裂率、囊胚率与培养Oh、16h、26h试验组差异显著(38．3％vs13．3％、26．7％、28_3％；13．O％VS0％、6．3％、5．9％，P<0．05)，而培养16h、26h两个试验组之间差异不显著(P>O．05)。结果表明：成熟培养24h的卵母细胞OPS玻璃化冷冻效果最好，成熟培养16h、26h次之，而不经过成熟培养的卵母细胞玻璃化冷冻效果最差。3．研究了不同化学激活方法对绵羊孤雌生殖胚胎发育的影响。

4、在囊胚率上，Ionomycin联合6-DMAP与联合6-DMAP+CB差异不显著，而与联合CB组差异显著(P<0．05)，与单独Ionomycin激活差异极显著(P

5、雌生殖胚胎发育的影响。结果发现：1．2Kv／cm的直流脉冲具有最佳激活效果，与1．6Kv／cm组差异不显著，但与0．8Kv／cm、2．0Kv／cm组在卵裂率、囊胚率上差异显著。脉冲次数3次效果最好，其卵裂章、囊胚率显著高于2次脉冲(P<0．05)，与1次脉冲差异极显著(P<0．01)。5．分析了不同成熟时间卵母细胞和不同时期卵母细胞去核的效率。研究发现：(1)绵羊卵母细胞体外成熟培养19～21h的较适合于作为受体细胞进行绵羊核移植；(2)TII期去核能够用于绵羊核移植，但不能提高重构胚的发育能力。6．研究了去核卵母细

6、胞的高渗处理和供体细胞的血清饥饿处理对绵羊核移植效率的影响。结果表明：(1)高渗处理可以显著提高带下注核效率和融合率，但对重构胚以后的发育没有影响；(2)血清饥饿和高汇合度处理供体细胞两者没有显著差异，但两者在融合率上显著高于原代颗粒细胞。关键词绵羊卵母细胞，体外成熟，玻璃化冷冻，孤雌激活，核移植PARTHENoGENETICACTI、，A~TIONANDSOMATICCELLNUCLEARTRANSFERlNSHEEPABSTRACTMammaliansomaticnucleartransplantationisa

7、complicatedandorderfulprocess．Thispaperresearchedtheprocessesofsheepoocyteinvitromaturation、parthenogeticandthereconstructionofembryo，andestablishedaseriesofmoresteadynucleartransfersystem．Theresultsareasfollows：1．Theinfluencingfactorsc,oncernsheepoocyteⅣMincul

8、turemediumwerestudiedthough3methods．Thatwas：theconcentrationofepithelialgrowthfactor(EGF)．theconcentrationofFSHandLHandtheadditionofdifferentdiameterfollicuteliquid．Itshowed