温度诱导的脂质运载蛋白(til1)参与拟南芥雌配子发育研究

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1、万方数据SichuanAgricutuarlUniversityMasterDissertationResearchofTemperature—inducedlipocalin(TILl)requiredforthedevelopmentoffemalegametophyteinArabidopsisthalianaByChangXiao—yanSupervisor：ProfessorFuFeng—lingVice—professorQinYuanMajor：BiochemistryandMolecularBiologyDirection：Pl

2、antMolecularBiologyMay，2014万方数据论文独创性声明本人声明，所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其他教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：帛d、拖时间：知fc弹6月¨日关于论文使用授权的声明本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交

3、论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。研究生签名：单￡l、拖时间：’otqif-易月ff日导师签名：日万方数据摘要脂质运载蛋白家族是一大类细胞外小蛋白，分布在质膜的周围并广泛存在于细菌、原生生物、节肢动物、脊索动物和植物中。拟南芥中的脂质蛋白只有一种称为温度诱导的脂质运载蛋白(TILl)，定位在细胞质膜，在拟南芥的根、茎、叶、花和角果中均有表达，对拟南芥种子萌发、营养生长、开花时间、叶片的衰老以及种子的产量均

4、无明显影响。已有研究结果表明，TILl基因主要参与拟南芥对逆境胁迫的调控，包括对温度、光照、高盐和氧化物等胁迫的调控。·本研究观察了T-DNA插入TILl编码基因的突变体Salk136775c的表型，发现角果结实率下降，突变体有明显育性降低表型。综合运用多种现代生物技术，对TILl参与雌配子体发育的机理进一步分析探讨，主要结果如下：1．角果结实率观察发现，till．J突变体结实率下降约20％育性降低明显，未发育为种子的胚珠呈白色的小点，而突变体till．2和till．3也均有育性降低表型，由此推测，TILl基因参与种子发育过程，till—J突变

5、体在合子发育早期或配子体发育过程中有缺陷。2．半定量RT．PCR和实时荧光定量Q．PCR分析表明，T．DNA插入使得TILl基因敲除，导致其功能缺失，引起till．J突变体育性降低表型。3．分别以去除雄蕊的till—J突变体的雌蕊为母本、野生型拟南芥的花粉为父本，纯合的脚一J7雌蕊为母本、till—J『突变体的花粉为父本，分别进行杂交试验。结果表明，till．．7突变体的胚珠败育发生在配子体发育时期，而不是合子发育早期。4．Alexander染色和花粉离体培养结果表明，till．J突变体雄配子体发育正常，突变体育性缺陷不是来源于雄配子体。5．胚

6、珠透明实验表明till—J突变体胚珠功能大孢子能正常的形成，并能正常进行三次连续的有丝分裂过程，但大孢子在进一步的发育过程中发生败育，造成成熟雌配子体发育缺陷，影响突变体育性。6．用野生型拟南芥TILl基因与绿色荧光蛋白基因GFP构建融合表达载体转化till—J突变体，可以明显恢复育性降低表型，并发现TILl基因在成熟雌配子胚囊中万方数据富集表达，在幼苗茎的维管组织和根中也有表达。7．在突变体till．Jr争At2933830和At2927420分别是上调幅度和下调幅度最大的两个基因，但与之对应的Salk098437c和Salk085797c两

7、个突变体并无育性降低的表型，"证f1]]At2933830和At2927420基因与TILl基因突变引起的育性降低表型无直接关系。上述结果表明，TILl基因突变，拟南芥出现育性降低表型，TILl基因参与胚珠的发育，种子的形成过程。till．j突变体中雄配子配子体发育正常并具有正常的育性，雌配子体功能大孢子能正常形成，并能进行三次连续的有丝分裂，但形成的成熟雌配子体发生缺陷，从而造成till．．f突变体育性降低表型。关键词：拟南芥；脂质运载蛋白；温度诱导；结实率；雌配子体发育Ⅱ万方数据AbstractThelipocalinproteinfami

8、lyisalargegroupofsmallextracellularproteinsandwidelydistributedinbacteria，p