杂合抗菌肽hmcm和tp508融合蛋白在毕赤酵母中的表达及青蒿无性繁殖技术研究

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1、重庆大学硕士学位论文杂合抗菌肽HMCM和TP508融合蛋白在毕赤酵母中的表达及青蒿无性繁殖技术研究姓名：赖文泉申请学位级别：硕士专业：生物学指导教师：陈国平20090603中文摘要摘要抗菌肽因其杀菌的高效性、广谱性和不易产生耐药性等特点受到广泛关注，在医药和农业等相关领域有广阔的应用前景。杂合抗菌肽是一类新型抗菌肽，它由来自两种或多种抗菌肽的部分肽链组成，具有高效、广谱、低毒、肽链较短等特点。人工设计杂合肽是研究的热点之一，即选择一种抗菌肽为蓝本，对某些氨基酸做删减替换或与另外一种抗菌肽的片段拼接。研究表明，一些经过改造

2、的抗菌肽具有与蓝本相似或更高的活性，毒副作用降低，而且变短的肽链为降低合成成本也奠定了基础。为了解决抗菌肽直接提取纯化困难、化学合成法成本较高、原核表达产物可能导致活性丧失并对宿主有害且难以纯化等问题，选择真核表达系统成为基因工程表达抗菌肽的理想选择。因此，探索并设计新肽，改善原有抗菌肽的活性，降低或消除他们的溶血性，高效表达目的小肽对解决目前抗菌肽存在的问题都有着重要的意义和实验价值。目前，源自不同蓝本的杂合抗菌肽研究颇多，从不同方面达到或接近了预期效果：鉴于还未见四段不同类抗菌肽杂合的报道，本实验做了一个大胆的创新，

3、由四段Hexapeptide(6)一Magainin(1．12)一CecropinA(1—7)．Melittin(5．12)拼接成杂合抗菌肽HMCM。为了加强杂合抗菌肽在临床上的实用性，在保留原有活性的基础上，本课题基于对活性抗菌肽构效关系的深入研究，将凝血酶激活肽TP508融合在HMCM的合理部位以增强其在临床应用时对伤口的愈合作用，同时，在目的蛋白N端增加一个6xHisTag以便于蛋白的分离纯化，以期为大量生产高效双功能抗菌肽提供有效的基因工程手段。本研究首次在毕赤酵母真核表达体系中表达了杂合抗菌肽和人凝血酶激活肽受

4、体TP508融合蛋白，根据设计的融合蛋白氨基酸序列和毕赤酵母的密码子偏好性，设计了六条引物经三轮PCR获得目的基因。将目的基因与毕赤酵母载体pPIC9K质粒重组构建表达质粒，电转化毕赤酵母GSl15宿主菌，经G418筛选得到高表达的阳性克隆，筛选鉴定为甲醇利用快型(Mu什)菌株，在摇瓶中实现融合蛋白的高效、稳定和分泌性表达。培养液上清经超滤离心、亲和层析纯化到单一的目的蛋白。同时，针对青蒿的自交不亲和性而引起的高青蒿素含量植株后代株系遗传不稳定的缺点，开展扦插生根研究，通过植物生长素促进青蒿生根，从而保持高青蒿素含量青蒿

5、后代的遗传稳定，突破了青蒿素含量这一性状不稳定的瓶颈。青蒿素是青蒿最重要的指标，本实验研究高青蒿素含量青蒿的繁殖方法，以重庆大学硕士学位论文提高青蒿中青蒿素的含量，探讨用不同类型植物生长激素对促进青蒿的无性繁殖的影响，为今后的培育高产青蒿打下一定的基础。关键词：抗菌肽，TP508，毕赤酵母，青蒿，无性繁殖H英文摘要ABSTRACTAnti—bacterialpeptideisakindofshortpeptidewhichcharacterizedbyhighantimicrobialactivities，wideant

6、imicrobialsectrumandnosideeffectsonanimals．Asidealsubstituteforantibiotics，ithasarousedpeople’Smoreinterests．Hybridantimicrobialpeptidesaleanewkindofdefenceactivepeptides，whicharecharacterizedbyhigherantimicrobialactivitiesandshorterpeptidechain,composedbypartpep

7、tidechainoftwoormoreanti-bacterialpeptides．Thedesignofanti—bacterialpeptideisahotspotwhichdesignedbyacidreplacementorsequencerecombinationwithotherpeptides．Thenewdesignedanti-bacterialpeptidesaremoreexcellentthantheoriginal．Thereweresomeproblems：isolationandpurif

8、icationoftheanti—bacterialpeptidesaredifficult，thehybridgeneproduceslittleamountofpeptidesmaykillitshostscells，thehybridpeptideswhichexpressinE．colimayloseacti