小麦抗病基因同源序列分析及条锈菌诱导的防御酶活性研究

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1、Y359237分类号Q343．1577四川农业大学硕士学位论文小麦抗病基因同源序列分析及条锈菌诱导的防御酶活性研究张彬指导教师鍪坯湓兹援学科专业生麴塑垄堂研究方向筮壬生物塑垄堂2006年5月摘要小麦条锈病是世界性的重要病害，严重威胁小麦生产。在我国，特别是西南麦区由于适宜的发病条件和现代农业造成的栽培品种和遗传背景的单一化，使得条锈病成为我国小麦生产上最为严重的病害，造成巨大的经济损失。本研究以小麦新品种川农17(R57)、川农19(R88)、及其它抗病品种(系)为材料，以条锈菌水源14、条中32和流行生理小种混合菌为诱导菌种，采用生化分析方法，RG

2、A分析技术，借助生物信息学分析手段，研究病原菌诱导后抗病相关防御酶系活性的变化规律；并对小麦抗病相关的基因片段进行分离、克隆，探讨这些特异性片段结构与功能的关系；同时对四川省普遍使用的小麦抗病遗传材料的抗病基因同源序列多样性进行分析，为进一步阐明小麦抗病生化和分子机制，抗条锈病基因的分离、克隆，合理选择小麦抗性亲本提供理论依据。主要研究结果如下：1病原菌诱导后抗、感小麦品种可溶性蛋白及防御酶系活性变化分析表明：1)条锈菌水源14、条中32分别接种后，抗、感品种的可溶性蛋白含量在48h后出现高峰，而混合菌种接种后可溶性蛋白含量高峰均推后到72小时。2)

3、抗病品种的SOD活性在接种(单、混合菌种)后在0-24h内均出现上升趋势，感病品种的SOD活性在该时间段均出现不同程度的降低趋势。3)抗病品种的POD活性在接种(单、混合菌种)后0-96h内总体上呈上升趋势，其最终活性均高于感病品种，而感病品种的POD变化呈现两个峰值；混合菌系接种后POD活性的变化较单菌接种显著。4)抗病品种的CAT活性在接种后0-24h迅速降低，此后略有回升，R88CAT活性总体上高于R57；感病品种在整个过程中CAT活性变化不明显；接种单菌系与混合菌系CAT活性变化无明显差异。2利用RT-PCR技术对小麦抗性材料进行扩增，共有7

4、8对RGA引物组合扩增出清晰可辨谱带，通过1．5％的琼脂糖电泳共检测出142条较强的条带，平均每对引物扩增出1．82条。其中，引物Xal．NBS．F／Xal．NBS．R在R88品种(接种诱导48h)中扩增出一条特异性条带RGA702；引物XalLR．F／XalLR．R在10N材料中(接种诱导24h和72h)均扩增出另一条特异性条带RGA200。序列分析表明：1)RGA702编码的氨基酸序列与玉米、黑麦草及水稻的蛋白磷酸酯酶2A相似达95％以上，该序列编码的产物可能参与植物抗病代谢过程。2)RGA200编码的氨基酸序列与大麦、水稻、玉米的酰基转移蛋白具

5、有较高的相似性(>76％)，但该序列含多个终止密码子，推测其可能是一个假基因。3根据小麦抗条锈病基因的NBS区域的保守结构设计两对引物，其中一对引物Z1／Y2在小麦品种R88和4个黑麦材料的基因组中分别扩增出2条长度为344bp(R88)和341bp(黑麦)的特异性条带。对其中的2个克隆RGARs8．1(R88)与RGARA．2(黑麦)序列比对分析，两者核苷酸序列相似性高达94．7％，编码的蛋白均具有NBS．LRR保守结构，各含一个开放阅读框，与禾本科其它属种的蛋白激酶、抗性蛋白复合体等具有较高的相似性，可能属于NBS-LRR抗病基因家族。这两条序列

6、的GenBank登录号为DQ494534和DQ494535。此结果表明，小麦新品种川农19(R88)的高抗条锈病特性可能与黑麦特性片段插入有关，为其抗性的来源提供了初步的分子证据。4通过RGAP方法对四川省主要利用的82份小麦抗病遗传材料进行了分析，筛选出多态性高的三对RGA引物组合：PtokinllN／Ptokin2IN、Cer31／XLRRINV2、AS3／$2，共获得123条带，其中54条带具有多态性，多态率达43．9％。UPGMA分析表明：1)在82份小麦抗性材料间存在丰富的抗病基因同源序列的多样性，聚类分析结果与相应的抗性鉴定结果基本吻合；

7、2)国外引进的抗性材料与四川省广泛使用的小麦育种亲本材料的抗性背景不同，两者之间能够很好地区分开来；3)课题组自育的R系材料具有广泛的抗性遗传基础，在大多数类群中均有分布。关键词：小麦；条锈病；抗病基因同源序列；克隆；防御酶系IIAbstractStriperust，causedbythefungusPucciniastriiformisWestendf．sp．triticiEriks．(Pst)isanimportantdiseaseofwheat(TriticumaestivumL．)throughouttheworld．InChina，espe

8、ciallyinthesouthwestprovinces，itisagreaterthreattowhea