南瓜nbs类抗病基因同源序列克隆和分析

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1、独创性声明本人声明，所呈交的学位(毕业)论文，是本人在指导教师的指导下独立完成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。学位(毕业)论文作者亲笔签名：雨砷年Etllll：≯母。6、J口论文使用授权的说明本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位(毕业)论文的规定，即学校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅：学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印，缩印或

2、其他复制手段保存论文。保密，在年后解密可适用本授权书．口不保密，本论文属于不保密。口学位(毕业)论文作者亲笔签名：商劢争日期：x07、。∥．J口指导教师亲笔签舞。2醐：。撕7．oo"．／o福建农林大学2007届硕士学位论文摘要南瓜(CucurbitamoschataDuch．)具有多种较强的抗逆性，如：抗寒、抗旱，抗病、抗贫瘠等，特别对瓜类枯萎病具有抗性，是嫁接同科作物甜瓜等较好的砧木．由尖孢镰刀茵甜瓜专化型病(Fusariumoxysporumf．sp．melonis)所引起的甜瓜枯萎病(Fusarium谢们是一种世界性的甜瓜病害．目前防治甜瓜枯萎病的主要途径仍然是运

3、用化学方法，这对人类的健康和生活环境存在着巨大的潜在威胁．采用常规育种方法选育抗病品种存在着育种周期长、效率低等不少缺点，因此，克隆南瓜抗病基因，则是当前利用分子技术进行甜嚆抗病育种工作的基础．本试验采用抗病基因同源序列(Resistancegcneanalog，RG舢克隆的策略。根据已克隆植物抗病基因产物的保守结构域一核苷酸结合位点(NBS)设计简并引物，以植物总DNA为模板进行PCR扩增，得到该植物的抗病基因同源序列(Resistancegeneanalog，RGA)，然后分析RGA与抗病基因的关系，确定候选抗病基因并最终获得新的抗病基因．本文以抗病性好的甜瓜嫁接砧

4、未一南瓜品种‘‘掘金龙”为研究对象，依据已克隆植物抗病基因的保守氨基酸结构域(P-loop和GLPL)设计合成了12条简并引物，用CrAB方法提取的南瓜基因组DNA作为模板，通过PCR方法及琼脂糖凝胶回收纯化技术。获得约500bp的目的扩增产物，将其与pMDl8-T载体连接并转化DH5a大肠杆茵，经过蓝白斑初步筛选，并经茵落PCR鉴定阳性克隆，经过限铺性酶切方法分类，测序获得了20个片段，经过在GenBank上使用Blast搜索和比对同源序列，结果表明有13个阳性克隆片段具有完整开放阅读框和NBS功能域，且与公布的甜瓜RGA之间存在较高的同源性，显示出两者同科的亲缘关系

5、．将其命名为SQRGAl一s0RGA6，SQRGA8一sQRGAl4，并提交GenBank，登录号分别为EFl01660一EFl01665，EFl01667。EFl99755一EFl99760．对这13条具有完整ORF的RGAs进行了结构功能域分析，结果表明：13条RGAs序列都包含NBS类抗病基因的四个保守模体：“P-bop'’，“Kinase．2”，“Kinase，3a'’和“GLPL区一．系统进化树分析表明：这13条南瓜RGAs可分为TIR．NBS．LRR和nonTIR．NBS-LRR，证实了以往报道的双子叶植物中存在两类NBS．LRR基因的结果．同源性比对结果表

6、明。13个南瓜RGAs与已知抗病基因有较高的同源性(18．4％一77．4％)．RGA序列SQRGAI．SQRGA6，sQRGA9．SQRGAl2所编码的要湛酸序列均与甜瓜的MRGH21有较高的同源性，为71．9％一77．4％．南瓜RGA的分离将为进一步从南瓜中分离功能性抗病基因打下基础，为研究南瓜种质资源的起源与进化提供借鉴．也为进一步获得他们的全长基因奠定了基础，可以利用RACE技术或者从南瓜基因组文库中筛选获得全长基因，为利用优良的抗性基因进行转基因甜瓜抗病分子育种奠定了物质基础．关犍词：南瓜保守结构域抗病基因同源序列克隆塑堡垒苎查兰!!塑星堡圭兰竺丝苎：ABSTR

7、ACTSquash(CururbitamoschataDuch．)possessesstrongresistanceabilitiestocoldness,出∞ght，manyd妇easepathogens，bⅢ-ren=sandespeciallyFusariumwilt,andSOitisgood舻mi略stockforthemelonofthefaw；flyCucurbitaceae．FIm加wilt，wh／chiscausedbyFⅢriumoxysporumf．sp．melonis。isonekindofworldm∞a∞sin