基于荧光激活微液滴分选的超高通量酶活筛选系统

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1、申请上海交通大学硕士学位论文基于荧光激活微液滴分选的超高通量酶活筛选系统学校：上海交通大学院系：生命科学技术学院学号：1110809070作者姓名：黄琛学科专业：生物学申请学位：理学硕士指导教师：冯雁教授上海交通大学生命科学技术学院2013年5月万方数据DissertationSubmittedtoShanghaiJiaoTongUniversityforMasterDegreeofScienceUltrahigh-ThroughputEnzymaticScreeningSystemBasedonFluorescenceActivat

2、edDropletSortingUniversity：ShanghaiJiaoTongUniversitySchool：LifeScienceandBiotechnologyStudentID：1110809070Name：HuangChenSpecialty：BiologyApplicationDegree：MasterofScienceSupervisor：Prof.FengYanSchoolofLifeScienceandBiotechnologyShanghaiJiaoTongUniversityMay,2013万方数据万方数

3、据万方数据基于荧光激活微液滴分选的超高通量酶活筛选系统摘要定向进化作为蛋白质工程领域的重要方法，通过构建随机突变库，并用具有针对性的筛选方式对突变体的性质进行评估和分选，从而实现酶功能在分子水平上的改造。目前限制定向进化成功的关键仍是缺少真正高通量、通用型的高效筛选方法。荧光激活微液滴分选（FluorescenceActivatedDropletSorting,FADS）方法是在微型液滴中进行酶反应，并通过荧光信号对酶活性进行高速定量分析和分选，因此成为目前最有潜力的超高通量筛选方法之一，并由于其通用性较好受到关注。然而，现有技术所生

4、成的微液滴均一性较差，影响FADS体系筛选的准确性和效率，从而严重限制了该体系的广泛应用。为了解决这一问题，本论文在膜挤出仪和微流控芯片两种不同的微液滴生成技术中进行了探索，重点研究了生成均一微液滴的方法，并考察了其用于FADS系统的可行性。一、对“膜挤出仪法-FADS”体系进行了系统优化与表征，并测试了其在酯酶筛选中的应用。本论文将互不相溶的两相液体（轻石蜡油和水）在膜挤出仪内反复挤压通过聚碳酸酯滤膜，实现乳化过程并得到微液滴。具体研究包括：（1）乳化次数的优化。确定了一级乳化次数为15.5-20.5次，二级乳化次数为25.5-30

5、.5次，同步提高了单层和双层微液滴的均一性。与常用的匀浆仪乳化法比较，膜挤出仪法保持了操作简便、液滴生成迅速的特点，而且在微液滴的均一程度上有着显著优势。验证了膜挤出仪法生成的微液滴中包裹单细胞的效率符合泊松分布；-12（2）酶反应的表征。确定了在皮升（10L）级别的微液滴中能够进行酶反应，且荧光信号稳定。筛选系统能够分辨不同底物浓度、不同酶浓度和不同酶活力形成的荧光信号差异，证明了此系统用于筛选的可行性；（3）酯酶活力的模式筛选实验。以表面展示酯酶AFEST的大肠杆菌细胞作为阳性个体，含有空质粒I万方数据pGF101的大肠杆菌作为阴

6、性对照，证明可在含大量阴性对照的群体中对少量有活性的阳性个体（如1/1000）进行富集，单次分选最高富集效率达到333倍以上，显示了该体系较高的筛选效率。经过优化和表征，“膜挤出仪法-FADS”体系的效率和稳定性得到了显著提升，拥有进行实际突变库筛选的巨大潜力。二、对“微流控芯片-FADS”体系进行了初步探索。本论文基于微流控芯片，通过连续相液流对分散相液流的剪切，模仿乳化过程从而制备得到微液滴。研究包括：（1）聚二甲基硅氧烷（PDMS）芯片的设计和优化。成功对芯片通道的流动聚焦结构、内部通道、接口与滤器等处进行了改良，提高了微液滴均

7、一性、操作稳定性和实验重复性；（2）溶剂系统的选择。确定了适合生成“水-油”（waterinoil,w/o）微液滴的油相为轻石蜡油，而适合“油-水”（oilinwater,o/w）微液滴的油相为碳氟油；（3）单层微液滴的制备。通过对芯片通道宽度、液流速度等条件的摸索，稳定地生成了不同直径大小（10µm和30µm）的单层微液滴，证明了影响液滴大小的关键因素为流动聚焦的尺寸；（4）液滴性质表征。经过系统优化的液滴具有极高的均一度和稳定性（在37℃下能够稳定超过24小时）；（5）单细胞包裹的尝试。针对进样过程中的细胞沉降现象，开发了使用羟乙

8、基纤维素作为增稠剂的有效解决方案，并发现了影响包裹效率的另一关键参数——液滴直径。初步建立的微流控实验平台为继续发展超高通量筛选方法奠定了基础。本论文面对建立通用型超高通量酶活性筛选方法这一目标，在FADS系统中进行了方