基因突变检测策略

《基因突变检测策略》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、37生命科学趋势2003年12月第1卷第4期TrendsinLifeSciences基因突变检测策略1213张明吴登俊郑鸿培刘玉良1四川农业大学动物科技学院胚胎工程与冷冻生物技术实验室2四川农业大学动物科技学院分子遗传实验室3四川农业大学动物科技学院胚胎工程与冷冻生物技术实验室在读硕士（责任编辑：race）摘要：基因突变检测在疾病诊断、分子标记辅助选择上有重要的应用价值。随着人类基因组计划的推进，基因突变检测技术手段得到了大的发展，本文简要阐述了目前各种直接针对遗传物质的直接的基因突变检测方法。

2、关键词：基因突变检测PCR随着人类基因组计划的推进，鉴定并描述的人类致病基因越来越多，致病基因突变检测可以更加广泛地用于临床诊断；随着动植物分子育种研究深入，主效基因标记精度越来越高。分子标记辅助选择逐渐成为现实，高精度标记的检测实质上就是突变检测。由于突变检测在疾病诊断与控制、遗传改良上重要的应用价值，大规模快速的基因突变检测研究受到了人们的高度重视。基因突变检测可以从两个层次入手：一是蛋白质层次的间接检测，主要借助一些蛋白质分析技术，分析突变体产生的变异蛋白，以及由变异蛋白引起的其他改变，如

3、菌落形态，抗生素抗性等；二是对遗传物质（主要是DNA）的直接检测，一般而言，这类技术都是通过建立一系列电泳，分析DNA构象或解链特性，或者利用DNA变性和复性等特性，进行DNA突变的分析。由于PCR技术的应用，基因突变检测主要以分析DNA变异的直接检测为主。下面简要阐述各种直接基因突变检测策略。1．单链构象异构多态分析技术（Single-strandconformationpolymorphism,SSCP）迄今为止，SSCP技术是最被广泛使用的。其基本原理是依据单链DNA在某一种非变性环境中具

4、有其特定的第二构象。DNA序列甚至单碱基变化都能导致这种空间构象的改变，在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中，构象不同导致电泳迁移率不同，从而将正常链与突变链分离出来。但是PCR-SSCP技术的突变出率只有50%-80%，而且SSCP的最适检测长度约为100-300pb。在SSCP技术的基础上，发展起来PCR-rSSCP，PCR-ddF，PCR-REF技术其检测效率更高。1.1RNA单链钩象多态性检测（PCR-rSSCP）与单链DNA相比，依赖链间互补的RNA构象对单个碱基的取代更敏感。如果将PCR引物

5、加上某种噬菌体启动子，比较转录后的待测样本与对照样本独特的RNA构象体的电泳迁移差异进行突变鉴定。由于电泳时无需稀释单链DNA防退火，便可以大量上样以非同位素方法检测。rSSCP检测200-400bp序列变异优于SSCP，检出率达到94%，此外，在此基础上改进得到了嵌套PCR-SSCP（αPCR-SSCP）法。1.2双脱氧测序单链片段构象多态性分析（PCR-ddF）-----------------------------收稿日期：2003-11-20接受日期：2003-12-04作者简介：张明

6、，目前在四川农业大学动物科技学院胚胎工程与冷冻生物技术实验室工作。3738生命科学趋势2003年12月第1卷第4期TrendsinLifeSciencesddF是SSCP的另一种改进技术，能够在相同条件下分析检测到几乎100%的突变。首先把PCR产物转录，再将转录本用逆转录酶进行Sanger双脱氧终止测序反应。通过观察非变性胶上经解链处理所产生的单链漂移，突变后终止片段的获得与缺失来判断突变。PCR-ddF法能够精确定位突变于10bp的范围内，假阳性率低于5%。然而，杂合突变必须经过双向测序方可

7、发现，并且为了保证100%的有效率，可检测范围以300bp为宜。1.3限制性内切酶指纹技术（PCR-REF）PCR-REF属于限制性酶切片段长度多态性（RFLP）与SSCP的优势组合，它可以用于检测相对较长的DNA片段有无突变。其方法是先将待检测的片段进行扩增，扩增时最好用pfu酶类，减少PCR引起的突变。然后将PCR产物用适宜内切酶消化，变性处理，继而进行SSCP非变性电泳，从而可以从同一块胶上获得判断突变的双重信息，一方面来自片段的长度，另一方面来自相同片段的构象差异。而且双重检测均分布在各

8、自的可信范围内。该技术确保了1kb片段内几乎所有突变的检测，在一块凝胶上能检测出50kb的基因组序列内几乎100%的突变。2异质性双链构象多态性分析（Heteroduplex,HTX）在固体支持物上电泳时，异质双链DNA（HTX）构象的变化决定了其电泳迁移率不同于纯合双链（homoduplexes）。基于这一原理的HTX分析，主要是把野生型和突变型双链扩增产物同时变性并混合变性，通过EB染色最终显示的电泳条带，分析相应序列结构的构象所决定的迁移位置变化，进而判断突变的有无。3变性梯度凝胶电泳（D