TGF-β受体在无功能垂体腺瘤中的表达水平与肿瘤侵袭性的关系.pdf

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1、分类号：R65密级：公开学校代码：11065学号：Y0115130113专业博士学位论文TGF-β受体在无功能垂体腺瘤中的表达水平与肿瘤侵袭性的关系作者姓名顾英豪指导教师丰育功教授主任医师专业领域外科学（神经外科）培养单位医学院答辩日期2018年5月8日TGF-β受体在无功能垂体腺瘤中的表达水平与肿瘤侵袭性的关系摘要目的：垂体腺瘤是最常见的中枢神经系统肿瘤之一。大多数原发性垂体肿瘤为起源于垂体前叶的良性肿瘤。垂体腺瘤根据其功能状态分为功能型垂体腺瘤和无功能型垂体腺瘤两类。无功能垂体腺瘤不产生活性激素，多数因占位效应而产生临床症状，如头痛、视野缺损和垂体功能减退。尽管大多数垂体腺瘤在组

2、织学上为良性肿瘤，仍有大约25-55%的垂体腺瘤具有侵袭特性。部分无功能垂体腺瘤具有侵袭性，可侵入周围组织。手术切除仍然是无功能垂体腺瘤的主要治疗手段，然而对于侵袭性无功能垂体腺瘤而言，如肿瘤侵入海绵窦、第三脑室、斜坡等，则手术全切肿瘤困难，手术效果欠佳。无功能性垂体腺瘤的发病机制是一个复杂的过程。到目前为止，垂体腺瘤的侵袭机制仍未完全认识。转化生长因子-β（TGF-β）信号通路是人体细胞信号传导的关键网络，参与人体许多生理过程，比如增殖、分化、迁移、细胞凋亡、间质转化，它的误调节会导致肿瘤生长。典型的TGF-β信号系统开始它的生物功能通过配体与Ⅱ型丝氨酸/苏氨酸激酶受体（TGF-β

3、受体Ⅱ）结合，然后同Ⅰ型（TGF-β受体Ⅰ）结合形成复合体。此后，TGF-β受体Ⅱ可以磷酸化TGF-β受体Ⅰ并激活下游的Smad依赖性通路。在肿瘤的发生、发展过程中，TGF-β信号具有双重作用。在正常和癌前上皮细胞中，TGF-β表现为肿瘤抑制作用，然而，随后的基因和后生改变使TGF-β信号的肿瘤抑制作用转化为肿瘤促进作用。除此之外，肿瘤细胞能够产生过多的TGF-β，从而促进肿瘤生长、侵袭和转移。TGF-β受体有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ共3种亚型，其中Ⅰ型和Ⅱ型受体是TGF-β信号传导所必需的跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶，主要介导TGF-β的作用，在TGF-β信号系统中发挥关键作用。有研究表明TGF-β受

4、体的不正常表达参与了肿瘤的生长与侵袭。其中，TGF-β受体Ⅱ是TGF-β信号的首要因素，TGF-β受体Ⅱ不正常表达会导致细胞生长和侵袭的不受控制。TGF-β受体Ⅱ在肿瘤的形成和发育中起重要作用。TGF-β受体Ⅱ一直被认为是一种肿瘤抑制剂，沉默或突变的TGF-β受体Ⅱ不能与抑制肿瘤细胞增殖的TGF-β1结合，这使得细胞增殖不受抑制且凋亡减少，由于其沉默或突变可导致肿瘤的发生。许多研究已经证实在正常垂体组织及垂体腺瘤中有TGF-β和TGF-β受体的表达。然而，TGF-β受体在无功能垂体腺瘤中的表达情况仍不清楚，特别是其在侵袭性无功能垂体腺瘤和非侵袭性无功能垂体腺瘤中的表达差异尚未有深入研

5、究。此外，TGF-β受体在无功能垂体腺瘤的发展及侵袭过程中的作用还没有完全被理解。I本实验通过qRT-PCR和Westernblot探索TGF-β受体在正常垂体、侵袭性无功能垂体腺瘤及非侵袭性无功能垂体腺瘤中的表达差异，并选择增殖细胞核抗原来评估无功能垂体腺瘤的增殖能力，进一步研究TGF-β受体Ⅱ与无功能垂体腺瘤的侵袭性之间的关系。方法：1.病人和样本选取青岛大学附属医院在2009年1月至2012年12月期间诊断为无功能垂体腺瘤的病人。这些病人均通过临床症状、垂体激素、磁共振成像（magneticresonanceimaging，MRI）和组织病理信息被确诊为无功能垂体腺瘤，均接受了

6、经蝶或开颅手术切除治疗。无功能垂体腺瘤通过Knosp分级方法被分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级。其中，Ⅰ、Ⅱ级无功能垂体腺瘤被定义为非侵袭性无功能垂体腺瘤，Ⅲ、Ⅳ级无功能垂体腺瘤被定义为侵袭性无功能垂体腺瘤。同时，我们收集了五位器官捐献者的正常垂体前叶组织，以此作为正常对照组。2.实时定量逆转录多聚酶链反应通过手术切除获取组织标本后置于液氮中进行保存。提取总RNA后合成cDNA。荧光定量PCR反应条件为50℃2分钟，95℃2分钟，（95℃15秒，60℃30秒）×40个循环。GAPDH作为基因表达分析的内对照。3.蛋白质免疫印迹法从肿瘤组织中提取30ug蛋白，然后完成聚丙烯酰胺凝胶电泳和转膜。使用

7、5%牛血清白蛋白进行封闭后，将PVDF分别加入TGF-β受体Ⅰ抗体（1:1000）、TGF-β受体Ⅱ抗体（1:1000）和GAPDH抗体（1:5000），在4℃环境下孵育过夜。然后，在膜上加入羊抗兔抗体进行孵育。蛋白条带通过ECL方法进行显影并立即在显影底片上曝光。用QuantityOne软件进行灰度扫描，半定量测定Westernblot条带的光密度值。4.免疫组织化学方法将所有组织进行石蜡包埋制备石蜡标本，并做5um厚度的连续石蜡切片。石蜡切片置入0.0