土壤中产ε-聚赖氨酸菌株的筛选、发酵及其发酵产物提取.pdf

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1、分类号：密级：学号：2015200602单位代码：10759石河子大学硕士学位论文土壤中产ε-聚赖氨酸菌株的筛选、发酵及其发酵产物提取学位申请人王昭君王绍明教授指导教师赵志军副研究员申请学位门类级别理学硕士学科、专业名称生态学研究方向绿洲农业生态所在学院生命科学学院中国·新疆·石河子2018年6月Screening,fermentationandextractionofε-poly-L-lysineproducingstrainsinsoilADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPa

2、rtialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofNuturalScienceByWangZhao-jun(Oasisagriculturalecology)DissertationSupervisor:Prof.WangShao-mingJune，2018土壤中产ε-聚赖氨酸菌株的筛选、发酵及其发酵产物提取土壤中产ε-聚赖氨酸菌株的筛选、发酵及其发酵产物提取摘要ε-聚赖氨酸（ε-poly-L-lysine，ε-PL）是由25~35个L-赖氨酸单体通过α-COOH和ε-N

3、H2脱水缩合而成的氨基酸同型聚合物，分子质量通常为3500~4500Da。ε-PL具有广泛的抑菌谱，且稳定性强，安全高效。在日本、韩国和美国等国家已经获得广泛应用；在国内，2014年，ε-PL获得新型食品添加剂许可，且已经有少数厂家实现了工业化生产。为了进一步推进ε-PL的工业化生产，系统地探究ε-PL具有深远的意义。本文从产ε-PL的菌种筛选研究出发，经菌种鉴定后，通过摇瓶及发酵罐初步发酵考察了筛选菌株的ε-PL生产性能；通过分离提取工艺的初步探索，确定其提取分离的关键制约因素；为后期的菌种育种研究和提取工艺优化奠定基础。本论文

4、的具体研究内容如下：（1）采集土壤样品制成菌液，使用含2g/Lε-PL固体培养基，并结合亚甲基蓝透明圈初筛耐ε-PL的菌株，获得耐ε-PL生长的菌株；采用复合抗生素抑菌剂富集放线菌，结合亚甲基蓝透明圈初筛可能产ε-PL的放线菌。利用ε-PL与碘化铋钾试剂能发生特殊的沉淀反应，分离得到5株产ε-PL的菌株，经菌落形态和培养特征及16SrDNA分析，鉴定为：1株解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens，1株蜡样芽孢杆菌Bacilluscereus，1株链霉菌属菌株Streptomycessp.，1株糖多孢属菌株

5、Saccharopolysporasp.，1株白色链霉菌Streptomycesalbulus。（2）对5株菌株摇瓶发酵，通过高效液相色谱进行定量分析，ε-PL产量分别为0.08g/L，0.06g/L，0.70g/L，0.82g/L，1.56g/L。对其中1株ε-PL产量最高的白色链霉菌Streptomycesalbuluswzj5进行5L发酵罐发酵，产量为6.99g/L。提取发酵产物进行薄层层析分析，结果表明，郑州拜纳佛公司的ε-PL和本试验粗提取的ε-PL的水解产物以及赖氨酸标品，三者在层析板上具有相同的Rf值，证明Strep

6、tomycesalbuluswzj5的发酵产物就是赖氨酸的聚合物。（3）通过单因素试验优化了ε-PL的提取中三个重要步骤，分别是加热去蛋白、离子交换、活性炭去色素。去发酵液中杂蛋白蛋白的最优条件为：pH=3.0，时间=90min，温度=95℃，利用此优化条件去除了发酵液中80.18%的杂蛋白；离子交换的最优条件为：初始pH=9.0，树脂用量=125g/L，上样流速与洗脱流速均为3ml/min，根据此条件进行离子交换，ε-PL回收率平均为77.19%；去色素最优条件为：待脱色液pH=4.0，水浴温度=75℃，水浴时间=120min，

7、活性炭添加量=2%（w/v）。根据此条件进行色素去除，ε-PL回收率平均为92.18%，脱色率平均为83.06%。优化后的提取工艺ε-PL总回收率达31.36%。取提纯后的ε-PL固体粉末，用其进行对大肠杆菌的抑菌试验，最小抑菌浓度为0.25mg/ml。关键词：ε-聚赖氨酸；筛选；发酵；提取土壤中产ε-聚赖氨酸菌株的筛选、发酵及其发酵产物提取Abstractε-poly-L-lysine(ε-PL),whichusuallyconsistsof25～30residuesofanessentialaminoacidL-lysine,

8、isahomo-poly-aminoacidcharacterizedbythepeptidebondbetweenthecarboxylandε-aminogroupsofL-lysine,anditsmolecularweightisappro