沙门氏菌噬菌体SLMP1裂解酶的重组表达及噬菌体在水产品中的应用研究.pdf

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1、学校代码：10264研究生学号：M150250457上海海洋大学硕士学位论文沙门氏菌噬菌体SLMP1裂解酶的重组表达题目：及噬菌体在水产品中的应用研究RecombinantExpressionofSalmonellaPhage英文题目：SLMP1LysinandApplicationofPhageinAquaticProduct专业：食品工程研究方向：水产品质量与安全姓名：许东勤指导教师：王联珠研究员二O一八年五月十五日上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究

2、工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适

3、用本版权书。本学位论文属于不保密□学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日上海海洋大学硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注林洪中国海洋大学教授主席魏玉西青岛大学教授委员孔凡玉中国农业科学院烟草研究所研究员委员马翠萍青岛科技大学教授委员李兆新中国水产科学研究院黄海水产研究所研究员委员孙晓杰中国水产科学研究院黄海水产研究所助理研究员秘书答辩地点黄海水产研究所4号楼二楼会议室答辩日期2018年5月21日上海海洋大学硕士学位论文沙门氏菌噬菌体SLMP1裂解酶的重组表达及噬菌体在水产品中的应用研究摘要沙门氏菌(Salmone

4、lla)是一类寄生于人类和动物肠道内、生化反应和抗原构造相似的革兰氏阴性杆菌，主要通过家禽、肉类、奶类、蛋类、水产品等传播给人类，感染此菌会出现呕吐、腹泻、发热等症状，严重时会导致昏迷甚至死亡。水产品具有高水分、营养丰富等特点，如果储存不当，会使微生物大量滋生，从而导致产品腐败，缩短货架期。若污染食源性致病菌，则会严重危害人类健康，给国家造成巨大的经济损失。传统的食源性致病菌控制技术主要建立在化学制剂的基础上，而化学制剂的安全性在逐渐引起人们的担忧。因此，开发安全和高效的生物抑菌剂具有重要的现实意义。裂解性噬菌体及其裂解酶的发现与应用，为食源性

5、致病菌的控制提供了新的思路和技术，由于其具有安全、高效、特异性强、不影响食品的感官品质等特点，因此在食品安全领域具有十分广阔的应用前景。本文基于沙门氏菌噬菌体SLMP1，通过原核表达获得重组裂解酶，并分析了裂解酶的杀菌特性。此外，探讨噬菌体SLMP1在水产品中的应用，研究了噬菌体在三文鱼和扇贝柱中沙门氏菌的控制作用，筛选能与噬菌体复配的抑菌剂，将噬菌体与抑菌剂复配应用于生三文鱼中沙门氏菌的安全控制及产品保鲜。研究内容及主要结果包括以下几个方面：1.从噬菌体中提取基因组DNA，通过PCR扩增裂解酶基因lysSP1全长片段，将其插入原核表达载体pE

6、T-28a(+)，转化大肠埃希氏菌DH5a中，提取质粒，经过确证后获得重组表达质粒I上海海洋大学硕士学位论文pET28a-lysSP1。将重组质粒转化大肠埃希氏菌BL21并成功诱导表达，在37℃诱导4h，IPTG浓度为1mmol/L时蛋白表达量最高，为部分可溶性表达。表达产物经过超声裂解、Ni-NTA蛋白纯化柱纯化及脱盐柱脱盐，获得单一条带的目的蛋白即重组裂解酶LysSP1。采用考马斯亮蓝试剂盒测试蛋白浓度，稀释至0.1mg/mL用于杀菌特性分析。2.分析了噬菌体重组裂解酶LysSP1的最适作用条件，在EDTA浓度5mmoL/L，作用温度45℃

7、，pH9.0时杀菌效果最好。离子浓度3+2+为0.1mmoL/L时，Fe和Mg能抑制酶活；当离子浓度为1mmoL/L2+2+3+2+2+时，Zn，Mn，Fe，Mg，Ca对裂解酶均有不同程度的抑制作3+2+用，其中Fe对酶活影响最大，Mn次之。该裂解酶对鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门菌、大肠埃希氏菌、大肠埃希氏菌O157、鲍氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌、单核增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌均有不同程度的杀菌作用。3.探讨了沙门氏菌噬菌体SLMP1对生三文鱼片和扇贝柱中沙门氏菌的控制作用，噬菌体浓度越高，生三文鱼片和扇贝

8、柱中的沙门氏8菌数量越低，当噬菌体浓度为10PFU/g，杀菌效果最好。在该浓度2下，样品在不同温度储存一段时间后，沙门氏菌可以由初始浓度104CFU/