microrna-33a通过靶向hif-1α抑制黑色素瘤侵袭转移的分子机制研究

《microrna-33a通过靶向hif-1α抑制黑色素瘤侵袭转移的分子机制研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、万方数据中图分类号—R62—2+9UDC6lO博士学位论文学校代码幽密级纽microRNA．33a通过靶向HIF．1a抑制黑色素瘤侵袭转移的分子机制研究MolecularmechanismstudyofmicroRNA一33athroughtargetedH1F-lainhibittheinvasionandmetastasisofmelanoma作者姓名：学科专业：研究方向：学院(系所)：指导教师：徐丹临床医学外科学湘雅三医院罗成群教授论文答辩日期出!!：丝坦答辩委员会主席碰中南大学2013年10月万

2、方数据IIIIIlllIIIIIIllllllIIIY2687805本课题受国家自然科学基金课题项目资助课题编号：81171882万方数据学位论文原创性声明本人郑重声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谓{的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关

3、责任。作者签名：丝=垒日期：』翌丛年上月』日学位论文版权使用授权书本学位论文作者和指导教师完全了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定：即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版；本人允许本学位论文被查阅和借阅；学校可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或其它手段保存和汇编本学位论文。保密论文待解密后适应本声明。作者签名：铭一县一留万方数据microRNA．33a通过靶向HIF．1a抑制黑色素瘤侵袭转移的分子机制研究摘要：研究目的：探讨miR-3

4、3a／b在不同转移潜能人皮肤黑色素瘤细胞系中的表达特点和意义。干预不同人皮肤黑色素瘤细胞系中miR-33a／b表达后，体外实验水平观察细胞的增殖、粘附、运动、凋亡和上皮．间质转化等肿瘤细胞恶性生物学功能的变化。干预黑色素瘤A375细胞中miR-33a表达后，在体实验水平观察裸鼠皮下种植瘤的大小、体积、质量及肺脏转移灶数目的变化情况。探讨miR-33a／b影响人黑色素瘤细胞恶性生物学功能的可能机制。研究方法：通过real．timePCR法检测miR-33a／b在低转移侵袭力的皮肤黑色素瘤细胞株WM35及高

5、转移侵袭力的皮肤黑色素瘤细胞株WM45l、A375和SK．MEL．1中的表达量。明确miR-33a／b在黑色素瘤细胞系中的表达情况，筛选miR．33a／b高表达和低表达的黑色素瘤细胞系作为进一步的实验研究对象。构建pYr—LVX．pri—miR-33a慢病毒载体，并将其包装成慢病毒，然后感染A375细胞，建立hsa-miR-33a稳定过表达细胞系A375．pYr．LVX。pir-miR．33a；构建pYr-LVX．miR-33a-sponge慢病毒载体，并将其包装成慢病毒，然后分别感染WM35、WM45

6、1细胞，建立hsa—miR-33a表达抑制的稳定细胞系WM35一pYr-LVX．miR-33a-sponge和WM451-pYr-LVX．miR-33a．sponge。以miR-33a表达稳定上调／抑制细胞系为研究对象，运用MTT法检测细胞增殖能力；平板克隆形成实验检测细胞克隆数；流式细胞术检测细胞凋亡率；细胞划痕实验、Transwell实验检测细胞迁移侵袭力；WesternBlot法检测与EMT相关的E．钙粘连蛋白(E．Cadherin)、N一钙粘连蛋白(N．Cadherin)的表达情况。多层面探讨m

7、iR一33a的表达对细胞增殖、细胞凋亡、侵袭转移和EMT等表型的影响。通过皮下接种及尾静脉注射A375及A375一pYr—LVX—pir—miR．33a细胞建立裸鼠种植瘤及移植瘤模型，观察裸鼠皮下种植瘤的大小、体积、质量及肺脏转移灶数目的变化情况。采用生物信息学分析法预测H]F．1et可能为miR．33a的下游靶因；WesternBlot法检测miR-33a表达变化时HIF—lct蛋白的表达水平；应用双荧光素酶基因Ⅱ万方数据报告法进一步验证HIF—l0【是否为miR-33a的直接靶基因。研究结果：miR

8、-33a与miR-33b在低转移侵袭力的人皮肤黑色素瘤细胞株WM35中表达量均高，而在高转移侵袭力的人皮肤黑色素瘤细胞株WM451、A375和SK．MEL．1中的表达量相对较低(WM35>WM451>A375>SK．MEL．1)；上调A375细胞株中miR-33a的表达能抑制细胞增殖、侵袭转移和上皮一间质转化；抑制WM451和WM35细胞株中miR-33a的表达能促进细胞增殖、侵袭转移和上皮一间质转化；miR一33a对细胞凋亡的影响无统计学