罗非鱼NCC活性调控蛋白及效应因子的鉴定与功能分析.pdf

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1、√罗非鱼NCC活性调控蛋白及效应因子的鉴定与功能分析摘要非特异性细胞毒性细胞（NCC）是哺乳动物自然杀伤细胞的前体细胞，在鱼类先天性免疫中发挥着重要作用。非特异性细胞毒性细胞受体Ⅰ型（NCCRP-1）是该类细胞膜上关键的受体蛋白，是NCC发挥功能的分子基础。然而目前对于NCCRP-1介导的NCC活性调控网络与作用机理还缺乏系统的研究。为揭示鱼类NCC活性调控的作用网络及分子机理，本论文以南方主要养殖品种——尼罗罗非鱼（Oreochromisniloticus）为研究对象，从以下三方面开展了研究工作：（一）通过酵母双杂交文库法筛选NCCRP-1的互作蛋白，随

2、后采用点对点酵母双杂交进行验证；（二）通过分析鉴定得到的互作蛋白其对NCC的活性调控作用，初步阐明了NCCRP-1介导的NCC活化信号转导通路；（三）针对发现的新型激活型配体分子CD80/86的功能以及NCC的效应分子NK-lysin进行了初步探究。取得的主要研究结果如下：1、罗非鱼NCCRP-1的表达特征及其互作蛋白的获取和验证获得罗非鱼NCCRP-1（On-NCCRP-1）的cDNA序列和基因组序列，并发现On-NCCRP-1在NCC的全细胞均有分布。qRT-PCR分析发现，On-NCCRP-1在罗非鱼的肝脏和头肾组织有较高分布。不同刺激物刺激后，On

3、-NCCRP-1的表达量在各组织及NCC中均出现显著性上调。结果表明On-NCCRP-1作为NCC受体分子，在介导鱼类免疫应答中起着重要作用。根据On-NCCRP-1的基因序列特征分别构建NCCRP-1全长、胞外结合区域以及胞内转录活化区+信号转导区三个酵母双杂交诱饵质粒，并构建罗非鱼头肾与肝脏酵母双杂交cDNA文库。利用三个诱饵载体分别从肝脏和头肾cDNA文库中筛选潜在互作蛋白。最终获取11个与NCCRP-1有潜在相互作用的基因序列片段，最终克隆获得10个基因的ORF序列。进一步使用酵母双杂交技术对此10个基因与NCCRP-1进行点对点验证，发现On-N

4、CCRP-1可与罗非鱼C-typelectin（On-C-typelectin）、罗非鱼serotransferrin（On-serotransferrin）相互作用。结果成功获得两个胞外蛋白分子可与On-NCCRP-1相互结合。2、依赖于NCCRP-1受体介导的NCC活性调控罗非鱼On-C-typelectin具有凝集素家族典型的CRD结构域。qRT-PCR分析发现，其广泛分布于罗非鱼多个组织，且在肝脏中表达量最高。无乳链球菌刺激后，On-C-typelectin在多个组织中均于早期发生显著性上调，表明该基因在细菌感染早期的免疫应答中发挥重要作用。利用O

5、n-C-typelectin和On-serotransferrin重组蛋白对体外分离的NCC进行刺激，发现3h和6h均可诱导部分NCC毒性效应分子高表达，表明NCC被激活。同时用诱导3h的NCC对FHM细胞进行毒性实验，发现On-C-typeIlectin和On-serotransferrin重组蛋白均可有效诱导FHM细胞凋亡信号开启，而使用抗On-NCCRP-1抗体封闭On-NCCRP-1，可抑制NCC对FHM的杀伤活性。结果表明，On-C-typelectin和On-serotransferrin均可通过受体On-NCCRP-1介导NCC的杀伤活性。酵

6、母双杂交实验发现On-NCCRP-1可与On-SKP1相互结合，而Skp1-Cul1-F-boxprotein(SCF)泛素连接酶复合物在催化蛋白泛素化过程中起着重要作用，结果表明On-NCCRP-1可能会介导泛素化作用。双荧光素酶报告系统检测发现，On-NCCRP-1过表达可激活NF-κB转录活性。推测On-NCCRP-1可能与On-SKP1结合后参与泛素化作用，进一步促进NF-κB抑制物IκB的降解，从而有效促进NF-κB信号转导。3、不依赖于NCCRP-1受体介导的NCC活性调控分析了罗非鱼CD80/86基因（On-CD80/86）和CD28基因（O

7、n-CD28）的结构特征。qRT-PCR结果显示，On-CD28和On-CD80/86可在罗非鱼各组织中检测到，且分别在胸腺和心脏中表达量最高。无乳链球菌刺激后，On-CD28和On-CD80/86在多种组织中表达量均显著上调。然而，对头肾组织淋巴细胞刺激后发现，On-CD28和On-CD80/86表现出不同的表达特征。体外互作实验表明On-CD80/86可与On-CD28相互作用，但不能和On-NCCRP-1相结合。且发现On-CD80/86不依赖于受体NCCRP-1介导即可诱导NCC效应分子的表达，以及提高NCC对CIK细胞的杀伤作用。以上结果表明On

8、-CD80/86与On-CD28互作为罗非鱼T细胞活化提供共刺激信