罗非鱼皮多肽抗皮肤光老化作用研究.pdf

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1、分类号：O629.72密级：UDC：610学号：2111507012硕士学位论文罗非鱼皮多肽抗皮肤光老化作用研究李东东指导教师：李思东教授孔松芝讲师申请学位类别：理学硕士领域名称：海洋化学研究方向：海洋生物资源利用化学学院名称：海洋与气象学院中国·湛江2018年6月罗非鱼皮多肽抗光皮肤老化作用研究摘要多肽链经过盘旋折叠形成具有一定空间结构的蛋白质，多肽是由20种氨基酸按不同比例组成，因其具有良好的抗氧化、延缓衰老、促进细胞再生以及很多独特的生理活性，在医药、功能食品和化妆品等领域应用广泛。鱼皮是提取胶原多肽

2、的理想原料，罗非鱼皮的干物质70%是胶原蛋白。本文以罗非鱼皮作为原料，采用木瓜蛋白酶和中性蛋白酶混合酶解法制备罗非鱼皮多肽（tilapiaskincollagenpolypeptide，TSCP），分别通过陶瓷膜微滤系统和低压循环超滤系统对酶解液进行分离处理，利用反向高效液相色谱（RP-HPLC）纯化并串联质谱法（MS/MS）通过Maxquant软件检索鉴定多肽氨基酸序列，随后测定其氨基酸组成与含量，有毒物质、重金属及微生物含量，以及DPPH、·OH和·O2-的清除率。同时采用人成纤维细胞（HDF）体外划痕

3、融合实验评估TSCP的活性，进而以紫外线UVB和UVA为辐射光源建立BALB/c裸鼠皮肤光老化模型，小鼠背部涂布TSCP治疗皮肤光老化，通过裸鼠背部的表观变化进行宏观评分、检测皮肤含水量变化及HYP含量初步考察TSCP抗皮肤光老化药效。为进一步研究TSCP治疗皮肤光老化的作用机理，采用生化定量方法测定小鼠皮肤内SOD、GSH-Px、CAT的酶活性及MDA含量，免疫组化分析MMP-1/3含量，结合HE染色，Masson染色和Victorinblue染色观察研究胶原纤维和弹性纤维形态及分布的影响。主要研究结论如

4、下：（1）料液比1:3，温度50℃，0.3%中性蛋白酶和0.05%木瓜蛋白酶混合酶解罗非鱼皮，酶解液离心后经200μm陶瓷膜微滤，1kDa分子膜过滤系统过滤后浓缩喷雾干燥制备的产物主要是多肽，呈淡黄色，有土腥味。TSCP中铬、镉和铅的含量低于国家标准，铬含量为0.31mg/kg，其中镉和铅均未检出，有毒物质无机砷、甲基汞、N-二甲基亚硝酸和多氯联苯均未检出，细菌总数为40cfu/g，远低于国家微生物限定标准1000cfu/g，其中霉菌、酵母菌、大肠菌群、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌均未检出。TSCP分子量主要是

5、＜1000Da多肽，其质量分数为92.96%，鉴定的175条肽链，含有17种氨基酸，其中8氨基酸的肽链为151段，离子或分子碎片质荷比（m/z）为720~3500。RP-PHLC分离纯化TSCP，收集了两个组分TSCP-3和TSCP-4，ESI-MS/MS检测鉴定为四肽Asn-His-Arg-Tyr（488.4Da）和Gly-Asn-Arg-Gly（472.3Da）。（2）TSCP体外活性显示：TSCP具有良好的抗氧化活性，能够抑制活性自由基，包括DPPH、·OH和·O2-，并以VC作为阳性对照。TSCP和

6、VC对DPPH的半抑制率（IC50）值分别为3.875mg/mL和2.289mg/mL，以及对超氧自由基的IC50值分别为0.849mg/mL和0.242mg/mL。TSCP的清除羟自由基IC50值为0.443mg/mL。皮肤成纤维细胞（HDF）体外划痕试验结果表明：与空白组（normalgroup）对比，TSCP在浓度为50µg/mL-150µg/mL之间，分别培养12h、24h及36h均有显著促I进HDF划痕融合的作用（P＜0.05vsnormalgroup），且对浓度有依赖关系，在浓度200µg/mL

7、时，则HDF融合作用不显著；＜1000Da超滤组分浓度为50µg/mL、100µg/mL及150µg/mL时，分别培养24h时，显著促进HDF融合率（P＜0.05vsnormalgroup），在相同培养的时间比空白组分别提高了26.67%、35.00%和13.66%，培养36h时，50-150µg/mL作用的HDF融合率已达到100%。（3）在体初步药效研究显示：TSCP可显著改善小鼠光老化皮肤的表观，适量TSCP（200，400，800mg/ml）增加皮肤的弹性和胶原蛋白的水合程度（P＜0.05vsmod

8、elgroup），提高了表观得分，高剂量组小鼠皮肤皱纹减少，无破损及发炎现象，红润有光泽，表观恢复程度接近正常组，中低剂量组效果次之；此外，VE组小鼠皮肤有明显的改观，表明其有一定的修复效果，原因可能是VE有较强的自由基清除活性。羟脯氨酸（HYP）是合成皮肤胶原蛋白的前体氨基酸，可促进蛋白再生延缓皮肤衰老，修复损伤皮肤代谢机能。TSCP治疗组（尤其是高剂量组），小鼠背部皮肤HYP含量显著提高（P＜0.05vsmo