基于群体感应信号分子AHLs降解酶解析腐败希瓦氏菌对副溶血弧菌毒力的影响.pdf

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1、分类号：TS201.3UDC：579.6硕士学位论文基于群体感应信号分子AHLs降解酶解析腐败希瓦氏菌对副溶血弧菌毒力的影响郭沐晗指导教师：孙力军教授申请学位类别：工学硕士专业名称：食品科学与工程研究方向：水产食品质量与安全学院名称：食品科技学院中国·湛江2018年6月基于群体感应信号分子AHLS降解酶解析腐败希瓦氏菌对副溶血弧菌毒力的影响摘要副溶血弧菌是目前海产食品中危害最大的致病菌，已受到广泛重视。前期研究发现，其毒力因子，直接溶血素、总溶血活性以及生物被膜的生成均受到共生环境中海产品优势腐败菌腐败希瓦氏菌的正调控，而在这种调控作

2、用中群体感应起到关键作用。然而腐败希瓦氏菌是如何通过群体感应调控副溶血弧菌毒力的，目前并不清楚。本研究拟通过细菌共培养、蛋白分离纯化、生物信息学分析和腐败希瓦氏菌酰胺酶异源表达，探讨腐败希瓦氏菌对副溶血弧菌毒力的影响因素及作用机制。1.将副溶血弧菌标准菌株与腐败共生菌株共培养，比较腐败共生菌对副溶血弧菌tdh基因、溶血活性等毒力的影响，发现在所选共生菌株中腐败希瓦氏菌对副溶血弧菌有显著的毒力增强作用。将腐败希瓦氏菌培养上清液与副溶血弧菌亲本株及AHLs信号分子合成酶luxM基因缺陷菌株共培养，发现腐败希瓦氏菌培养上清液可以通过干预副溶

3、血性弧菌群体感应AHLs信号分子提高溶血性弧菌毒力因子tdh基因的表达。2.腐败希瓦氏菌降解信号分子的粗蛋白分离纯化包括超滤离心管粗提取、Sephadex200柱层析和SDS-PAGE电泳三个步骤。经Sephadex200分子筛柱层析进行分离纯化，然后以特定吸收波长276nm检测吸收值并绘制洗脱曲线，并分别收集获得三个蛋白洗脱峰，将收集的洗脱峰再次通过超滤离心管超滤后，得到蛋白分离峰的浓缩液F1、F2和F3。分别比较三个洗脱峰对副溶血弧菌信号分子的降解活性。发现，F1、F3无降解活性，F2降解副作用明显。结果表明，腐败希瓦氏菌培养液中

4、存在降解副溶血弧菌AHLs信号分子的蛋白。3.根据NCBI数据库及腐败希瓦氏菌基因库信息，获得酰胺酶acylase基因，对其进行生物信息学分析，推测酰胺酶基因的基本理化性质，空间结构保守，较为稳定，是胞外分泌蛋白，其关键功能域为Ntn_hydrolase。推测其具有降解特定酰基底物的功能，推测其可通过破坏AHLs信号分子的酰基调控副溶血弧菌毒力。4.通过基因合成、重组质粒构建并转化入大肠杆菌中，诱导其表达，并经分离纯化获得较纯的酰胺酶。以副溶血弧菌信号分子降解率为指标，对酰胺酶acylase的酶学特性进行了研究，发现腐败希瓦氏菌酰胺酶

5、降解信号分子活性受温度、pH值影响，最适反应温度为37℃，最适pH值为8。实验中也发现酰胺酶受金属离子影响，一方面，当用金属离子螯合剂EDTA处理酶时，酶活力明显下降，说明该蛋白在发挥I2+2+作用时，需要金属离子的参与；另一方面，当反应体系中加入Mg、Fe时，酶活力明显增强，暗示微环境中的酸碱度、温度及金属离子影响共生菌对副溶血弧菌毒力的调控作用。本研究探明了腐败希瓦氏菌通过酰胺酶降解副溶血弧菌luxM编码的信号分子AHLs，调控副溶血弧菌毒力表达。初步对酰胺酶酶学特性进行研究，明确了腐败希瓦氏菌调控副溶血弧菌毒力的分子机理，但是对

6、其关键酶的酶活中心、关键结构域等仍不清楚，仍需要进一步研究。本研究基于群体感应信号分子AHLS降解酶解析腐败希瓦氏菌对副溶血弧菌毒力的影响，为在腐败菌共存条件下副溶血弧菌的毒性评价及控制方案的制定提供了理论依据。。关键字：群体感应，副溶血弧菌，腐败希瓦氏菌，酰胺酶，tdh基因表达，异源表达ⅡAnalysisoftheToxicityofShewanellaputrefaciensontheVirulentityofVibrioparahaemolyticusbasedonAHLSDegradationEnzymeAbstractVib

7、rioparahaemolyticusisthemostharmfulpathogeninmarinefoods.TheexpressionofthevirulencegeneisoftenregulatedbytheShewanellaputrefactioninthesymbioticenvironment,includingtdhgeneexpression,hemolyticactivity,andbiofilmformationareaffected.However,themechanismoftheS.putrefacti

8、ontocontrolthevirulenceofV.parahaemolyticusisnotclear.ThisstudyintendstoidentifythetypeofShewanellaputrefactiv