id1id3在子宫内膜癌中的表达及对子宫内膜癌细胞生物学的作用

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1、南方医科大学2010级硕士学位论文Idl／Id3在子宫内膜癌中的表达及对子宫内膜癌细胞生物学的作用TheexpressionofIdl／Id3inendometrialcarcinomaandroleofIdl／Id3inbiologicalfunctionofendometrialcarcinomacell课题来源：广东省自然科学基金No．$2012010009351广东省科技计划项目No．20078031001001学位申请导师姓专业名培养类培养层所在学人刊、丽丽名刘国炳主任医师副教授称妇产科型专业学位次硕士院南方医科大学南方医院2013年3月20日广州

2、II

3、MIlUlHIIIMMIIIIJIIJY2405643硕士学位论文Idl／Id3在子宫内膜癌中的表达及对子宫内膜癌细胞生物学的作用硕士研究生：孙丽丽指导教师：刘国炳主任医师副教授摘要【研究背景】分化抑制因子(inhibitorofDNAdifferentiation，Id)Id蛋白可与碱性螺旋．环．螺旋(Basichelix-loop．helix)转录因子作用，形成非活性异二聚体，阻止bHLH与靶基因DNA上的E启动子结合，间接地抑制分化相关基因的表达，影响肿瘤细胞的生长、血管形成、侵袭及转移能力，其中Idl／Id3具有许多重叠效益，在促进肿瘤细胞增殖和侵袭转移方

4、面具有协同作用，被认为是与肿瘤侵袭性相关的上游调控基因。近年来，基因治疗、靶向治疗作为肿瘤治疗的新生代模式日益受到重视。但目前对于子宫内膜癌的治疗还没有发现特有效的特异性标志物，对于生长转移的分子机理也缺乏一定的了解。关于Idl／Id3基因与子宫内膜癌发生、发展及侵袭转移的关系还没有相关研究。我们希望借此研究子宫内膜癌生物学行为的发生、发展及浸润转移机制，寻找一种新的治疗策略。【研究目的】检测Idl／Id3在子宫内膜癌组织中的表达情况。利用RNA干扰技术构建Idl／Id3双敲低腺病毒并感染人子宫内膜癌细胞株HEC．1．B和RL．952，通过观察Idl／Id3双敲低

5、后，对MMP2，CXCR4和P21在基因水平和蛋白水平的影响，推测Idl／Id3与P21、MMP2和CXCR4的关系，以及是否参与它们介导的细胞存活、细摘要胞增殖或趋化相关信号转导通路，研究子宫内膜癌细胞的浸润、增生及转移的机制。重点探讨双敲低Idl／Id3基因对子宫内膜癌细胞增殖能力、侵袭能力、迁移能力及粘附能力的影响，阐明Idl；ld3基因在子宫内膜癌生长转移中的生物学作用，检验干扰Idl／Id3是否可以有效治疗子宫内膜癌，为临床诊断和治疗提供理论依据。【研究方法】1．Westemblot检测Idl、Id3在子宫内膜癌组织内表达：将随机挑选的南方医科大学南方医

6、院妇产科2011年6月．2011年10月住院手术的4例子宫内膜癌患者新鲜组织及相应的癌旁组织提取全蛋白，根据BCA蛋白定量试剂盒进行定量，测定其在562nm处的吸收值(A562)。计算各浓度蛋白标准的平均吸光度，绘制标准曲线，计算回归方程。提取的总蛋白，加入2xSDS蛋白上样缓冲液(按1：1比例)，100℃煮沸5min，．20。C保存备用。Westernblot方法检测后观察凝胶图像，应用AdobePhotoshop图像软件扫描Westernblot凝胶图片，得到相应灰度值，观察4例子宫内膜癌组织及相应的癌旁组织中的Idl／Id3的表达。2．qRT-PCR检测不同

7、腺病毒载体感染子宫内膜癌HEC．1．B和RL．952细胞株后Idl、Id3、MMP2、CXCR4、P21mRNA水平：实验将两株细胞各分为未处理细胞组(简写contr01)、空白病毒组(vector)、启动子病毒组(promoter)、Idl／Id3双敲低组(RNAi)。对四组细胞进行提取RNA、去基因组、纯度检测和电泳检测、逆转录及定量PCR操作。采用△△CT法对荧光定量PCR结果进行定量分析，计算Idl／Id3双敲低后MM2、CXCR4、P21的表达抑制率。3．Westernblot检测不同腺病毒载体感染子宫内膜癌HEC．1．B和RL．952细胞株后Idl、I

8、d3、MMP2、CXCR4、P21蛋白表达量：对每株细胞的各四组细胞提取全蛋白，具体步骤同前。4．噻唑蓝(MTT)比色实验检测不同重组腺病毒载体感染子宫内膜癌细胞株Ⅱ硕士学位论文RL．952和髓C．1．B后对细胞增殖能力的影响：对RL．952及HEC．1．B细胞株各四组细胞加入MTT后，以空白对照孔调零，酶联免疫监测仪上490rim测定各孔光吸收值(D值)。各组取三孔平均值，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。实验重复3次。5．移行小室(Transwell)侵袭实验检测不同重组腺病毒载体感染子宫内膜癌细胞株RL．952和HEC．1．B后对细胞侵袭能力的

9、影响，一般