骨形成发生蛋白-2协同刺激钛颗粒诱导下的破骨细胞生成

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1、分类号：R6单位代码：10752密级：公开学号：2010365宁夏医科大学硕士研究生学位论文骨形成发生蛋白-2协同刺激钛颗粒诱导下的破骨细胞生成BMP-2andtitaniumparticlessynergisticallyactivatedosteoclastformation学位申请人：孙首选指导教师：金群华教授申请学位类别：医学专业领域名称：外科学研究方向：骨科学所在学院：临床医学院论文完成日期：二○一三年四月宁夏医科大学研究生院1NingxiaMedicalUniversityThesisforApplicationofMaster’sS

2、pecializedDegreeBMP-2andtitaniumparticlessynergisticallyactivatedosteoclastformationStudent’sName:SunShouxuanSupervisor:Jin-QunhuaProfessorSubjectCategory：MedicineMajor:SurgerySpecialty:OrthopedicsSchool：ClinicalinstituteCompletionDate:Apr.20132宁夏医科大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，

3、是个人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，无抄袭及编造行为。除文中已经特别加以注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明并致谢。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。论文作者签名＿＿＿＿＿论文导师签名＿＿＿＿＿年月日年月日宁夏医科大学关于学位论文使用授权的声明宁夏医科大学有权保留使用本人学位论文，同意学校按规定向国家有关部门机构送交论文的复印件和电子版，允许被查阅和借阅。本人授权宁夏医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行

4、检索，可以采用影印、缩印或其他复印手段保存和汇编本学位论文。可以公布（包括刊登）论文的全部或部分内容。（保密论文在解密后应遵守此规定）论文作者签名＿＿＿＿＿论文导师签名＿＿＿＿＿年月日年月日3宁夏医科大学硕士研究生学位论文中文摘要骨形成发生蛋白-2协同刺激钛颗粒诱导下的破骨细胞生成摘要目的：探讨骨形态发生蛋白-2（BMP-2）在磨粒诱导小鼠RAW264.7细胞分化成破骨细胞中的作用。。方法：1.将小鼠RAW264.7细胞培养于六孔板中，分别加入BMP-2蛋白，钛颗粒，BMP-2蛋白和钛颗粒进行培养，利用免疫组化，实时定量，免疫印迹等手段对分化的破

5、骨细胞进行检测。2.以腺病毒为基础将TNF-siRNA克隆入pSilencer2.1-hU6载体中，经PCR扩增后克隆入pGEMT载体，随后克隆入pAd5E1-MCS-CMVeGFP，形成带有绿色荧光标记的重组腺病毒Ad-TNF-siRNA；将带有BMP-2的pCDNA3.1载体克隆入pAd5E3-CMV穿梭质粒中，然后克隆入pAd5骨架，经扩增后将带有TNF-siRNA的腺病毒骨架和带有BMP-2的骨架经PacI酶切线性化后转染HEK293细胞，最终形成重组腺病毒Ad-BMP-2-TNF-α-siRNA。3.将Ad-TNF-siRNA和Ad-B

6、MP-2-TNF-α-siRNA分别加入含有钛颗粒的RAW264.7细胞中，与只加入钛颗粒的细胞做对比，利用免疫组化，免疫印迹，实时定量等手段对分化的破骨细胞进行检测。结果：在本实验中我们发现BMP-2能够协同钛颗粒刺激小鼠RAW264.7细胞的分化。低浓度的BMP-2（30,50ng/ml）在刺激破骨细胞分化的大小，数量，细胞核数量，破骨细胞标志因子及骨吸收面积上都达到最佳刺激浓度，本实验还表明在破骨细胞分化早期，BMP-2能够促进c-fos与磷酸化的SMAD1/5/8的表达。BMP-2和钛颗粒能够协同刺激p-JNK,p-P38，p-IkB及p

7、50的表达。同时我们利用腺病毒构建携带TNF-α-siRNA（Ad-TNF-siRNA）和同时携带TNF-α-siRNA与BMP-2（Ad-BMP2-TNFsiRNA）的载体，将其转染加入钛颗粒的RAW264.7细胞中，发现两个载体都能抑制TNF-α的表达，但只有Ad-TNF-siRNA能够显著抑制小鼠破骨细胞的分化，而Ad-BMP2-TNFsiRNAIV宁夏医科大学硕士研究生学位论文中文摘要能够增加破骨细胞分化的大小，数量，细胞核数量，破骨细胞标志因子的表达及骨吸收面积的大小，并且其诱导破骨细胞分化水平与钛颗粒诱导RAW264.7细胞分化成破骨

8、细胞的水平相似。同时Ad-BMP2-TNFsiRNA能够提高早期破骨细胞分化标志基因c-Fos的表达，增强p-JNK和p-P38信号通路