现代分子生物学研究领域的新标记物

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1、维普资讯http://www.cqvip.com7l生物工程进晨'1997．Vo1．17，No．4绿色荧光蛋白——现代细胞生物学与分子生物学研究领域的新标记物430，(武援病=；ii靳而丽忑o72)ff，单．胁，．{iI八摘要从多管水母属Aequorenvicturia分离出的晕色荧光蛋白(GFP)，因其特有的生轴1化学性质及谖基因在异源知胞内的表达产轴亦能产生强烈的撵色荧光，使其在现代细胞直一盼迭艇馁L序智常需要用荧光物质作为标记。这种标记也是免粗提液中一定还有·种蛋白即绿色荧光蛋白疫荧光和免疫组化的基础。传统的荧光标记是(greenfluorescentprotein，GFP)[’”。

2、Morise通过纯化蛋白质再共价结合到荧光染料上，但荨[对GFP进行了分离和纯化，他们的实验结是化学计量和染料附着的部位难于控制，因此果表明，GFP的荧光发射峰在5O9nm，最大激尚需再次纯化。若该蛋白需用于活细胞内检测，发波长为395nm，并在475rim处有一肩蜂。当最关键的问题是如何使其通过细胞膜。现在可将ca”加入到含低浓度GFP的aequorin溶液用分子生物学的方法产生荧光蛋一白，以取代传一中时，光谱接近于aequorin发射的蓝光Ounax统的标记方法常甩的有荧火虫和细菌的荧光472nm){而将aequoriu和GFP按大自然比例素酶基因，但由于它们都需要底物和辅助因子，混合

3、时，加入ca“，则光谱接近于活体的发射因而在活体组织中的应用受蓟限制。由于绿色光(~aax50~rn)。推测在活体内，GFP通过荧荧光蛋白所特有的生物化学性质，且该基因在光素酶或钙活化光蛋白的能量转换过程，吸收异源细胞内的表达产物亦能产生强烈的绿色荧蓝光而后发出强烈的绿色荧光Aequorea发光光，使其在生命科学中的应用具有美好的前景系统分子闻的能量转换过程如下：本文就其研究进展进行简要综述。、Aequorin．=BFP‘+blueLightl一、绿色荧光蛋白的生物发光现象GFP即_+早在六十年代初期，Shimomura等0首先greenlight从多管水母属(Aequor／av／cto~

4、'a)中分离出一(BFP为蓝色荧光蛋白)种称为aequoria的蛋白，该蛋白在结合钙离子=、GFP的生色基团后可发射蓝光，当时称为光蛋白(photoprotein)。它是分子量为20kD的单一多从jdlyfishAequoreaviciorm分离出的肽链；在其发光前，1Mol的aequoria结合3MolGFP分子量约27—30kD，为一单链多肽，它的的钙离子及1Mol非共价键结合的腔肠动物荧生色基团(chromophore)在各种苛性条件下光紊。尽管光蛋白体系本身发射蓝光，然而水母(如热、极端pH、化学变性剂)都很稳定，比如用4O，●维普资讯http://www.cqvip.com酸、碱

5、、或盐酸胍处理，一旦恢复中性pH环境，biliproteins)的生色基团完全不同，它是由链内或是除去变性剂，荧光就可恢复并具有和原来几个被修饰的氨基酸残基经共价键连接而成。一致的发射光谱。绿色荧光蛋白独特的生物最初由Shimomura提出，并被大家所公认的生化学性质暗示它含有特殊的结构，它的生色基色基团化学结构见图1C：。团和另外一种荧光蛋白——藻胆蛋白(Phyco-岫0量r⋯．一一CH2OHc_。lNH2圈1·GFP的生色基宙化学结构示意圈构成生色基团的3个氨基酸：Ser-dehy-证实的gfpmRNA全长是1．05kb。2．5末端非droTyr—Gly位于第65—67位，生色基团由丝

6、编码区很短，只有26个核苷馥。3．无Poly(A)氮酸一脱水络氨酸一甘氨酸形成的对羟苯甲基尾，而gfpmRNA则有Poly(A)尾。从eDNA咪唑环酮(4．P-bydroxybene一5一imidazolinone)的序列推算：gfp含有一个开放阅读框，编码构成，其上游第8个氨基酸为色氨酸，不寻常的238个氨基酸，分子量为26888kD，同经sD{}一是这个色氨酸的荧光是检测不到的，可能是它PAGE测定的天然GFP的分子量(27-30kD)和生色基团之间的能量转移阻抑了色氨酸荧光比较接近。由于用来构建基因文库的A．victori-(320--350nm)，这个色氨酸附近有多个脯氨酸a基因组

7、DNA来自于大量的je．yfish组织，电残基(Pro-Val—Pm—Try-Pro)，它的重要性现在泳纯化的GFP显示至少有三种主要的同分异还不明了，但从蛋白质数据库(PIRver25}构体，其紫外吸收率(A395／A28O)均在1．10～Swiss—Protverl4)中只找到细胞色素P一450蛋1．25E。根据限制性酶切和Southernblot分析白具有这种结构。这些阳性克隆，也发现至少存在有三种不同的内讶酶图谱