用于内耳基因治疗的plga包裹的羟基磷灰石基因载体的构建

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1、中图分类号UDCR764．8+3610博士学位论文学校代码密级用于内耳基因治疗的PLGA包裹的羟基磷灰石基因载体的构建10533ThemanufacturingofanovelgenevectorcomposedbyanHAPcoreandaPLGAshellforgenetherapyoZtheinnerearl一‘一●作者姓名：学科专业：研究方向：学院(系、所)：指导教师：论文答辩日期高可雷临床医学耳鼻咽喉科学湘雅医院孙虹教授答辩委员会主席中南大学二0一三年五月原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下

2、进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信

3、息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。作者签名：——导师签资助本课题的科研基金：1．湖南省科技厅2007年度社发领域科技计划重点项目，2007SK2001；2．国家自然科学基金面上项目，30772402；3．国家自然科学基金面上项目，81170912；4．教育部博士点专项基金(博导类)，20110162110007。本研究在湖南大学化学材料实验室及湘雅三医院中心实验室完成。特此致谢!用于内耳基因治疗的PLGA包裹的羟基磷灰石基因载体的构建摘要背景：内耳后天的感音神经性听

4、力损失常来自于过度的噪音或耳毒性药物所造成听觉上皮毛细胞(Haircell，朋)的损伤，并伴发或继发螺旋神经节神经元(SpiralGanglionNeuron，SGN)的退行性改变。研究发现应用神经营养因子．3(Neurotrophin．3，Ⅳ互3)可以保护受损内耳中残存的毛细胞，预防SGNs变性。但这种治疗作用持续给与NT-3，短期使用NT-3后SGNs的远期生存率与不使用者没有显著差别。基因治疗经一次给药后可以持续作用，能避免手术操作的损伤和可能的感染，所以受到了研究者的青睐。本课题组2006年首次利用羟基磷灰石纳

5、米颗粒(Hydroxyapatitenanoparticles，nHAP)将NT-3基因转入豚鼠内耳并成功表达，之后围绕nHAP载体进行了一系列体内外转染实验。但这些实验中nHAP的转染效率不高，转染的特异性不强。因此课题组尝试用有机多聚物修饰nHAP的表面，以提高其转染效率、添加靶向转染的能力。本课题拟通过聚乳酸羟基乙酸共聚物(Poly(1actic．CO．glycolicacid)，兕G么)修饰nHAP表面，构建将要用于内耳基因治疗的新型基因载体。目的：构建PLGA包裹的羟基磷灰石基因载体。探索水包油包固体(Sol

6、id／Oil／Water，剐∥形)复乳法制备新载体的工艺；探索新载体的转染能力和应用于内耳基因治疗的可能性。方法：通过水热法合成羟基磷灰石纳米颗粒。通过水包油包固体(S／O腑)复乳法制备PLGA包裹的载体。根据复乳法的原理，选取四个关键参数：nHAP加入的质量，PLGA的浓度，超声乳化的持续时间和水相中聚乙烯醇(Polyvinylalcohol，P助)的浓度。探索它们对新载体尺寸的影响。最后以MTT(噻唑蓝)法测定新载体的细胞毒性，在Hela细胞中完成转染。结果：1)合成所得nHAP的直径为93．9土1．8nm，它在磷

7、酸盐缓冲液(phosphatebuffersolution，船S)中能以50：1的质量比吸附pEGFP．N1质粒(DNA)。2)S／0用复乳法的四个参数中：nHAP加入质量与载体粒径负相关，其影响有统计学意义(pO．05)，但它与PLGA浓度存在显著的交互作用，同时HAP加入质量和PLGA浓度也有交互作用，这两个交互作用对粒

8、径的影响有统计学意义(p均小于O．05)，并影响了最优参数的选择。3)S／O／W复乳法制备新载体的最优参数是：加入naaP20mg／ml，PLGA50mg／ml，超声时间4min(30／10s)，PVA浓度2％。4)成功制备了HAP．DNA．PLGA载体，其粒径为211．9士56．7nm。5)HAP．DNA．PLGA载体的理论载药