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时间:2019-10-17
《医学论文-用于基因治疗的慢病毒载体》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、医学论文•用于基因治疗的慢病毒载体基因治疗有望成为治疗遗传病、肿瘤、病毒感染及其它难治性疾病的有效手段,但目前基因转移方法的局限性成为实现这一希望的最人障碍。非病毒学的基因转移方法效率较低;已用于人体试验的基I大I治疗方案绝大多数是以病毒学方法进行基因转移的,其屮以逆转录病毒载体和腺病毒载体最为成熟。常用的逆转录病毒载体从小鼠口血病病毒(MLV)改造而来,虽可使目的基因整合至靶细胞基因组、实现稳定表达,但只能转导分裂细胞,目前主耍用于基因治疗的离体方案;腺病毒载体既能转导分裂细胞,亦可转导静止细胞,转导效率也较高,但FI的基因不整合至靶细胞基因组,仅能短暂表达,而且腺病毒
2、本身某些抗原的表达可引起人体免疫反应,阻止其重复转导;其它一些病毒载体如腺相关病毒(AAV)载体、单纯疱疹病W(HSV)载体亦因各种原因不能令人满意。理想的病毒载体能同时提供高效的基因转移、长期稳定的基因表达及牛物安全性。近来,一些研究者把目光投向了以I型为人免疫缺损病毒(HIV-1)为代表的慢病毒。研究表明C1-51,以HIV-1为基础构建的这类慢病毒载体具有可感染非分裂细胞、目的基因整合至靶细胞基因组长期表达、免疫反应小等优点,适于体内基因治疗,因此有望成为理想的基因转移载体。木文即对该类载体的研究进展做一简介。1H1V-1基因组的基木结构[6]HIV-1DNA前病毒
3、的主要结构基因及其排列形式与其它逆转录病毒相同,均为5’LTR-gag-pro-pol-env-3zLTR。其中gag基因编码病毒的核心蛋白,pol基因编码病毒复制所需的酶类,erw基因编码病毒的包膜糖蛋白,pro基因则编码切割蛋白前体所需的蛋白酶。与其它逆转录病毒不同的是,H1V-1基因组尚有较多调节基因,其中属于HIV-1基因复制所必需的tat基因和rev基因,分别编码两个反式激活因子Tat蛋口和Rev蛋口,前者在HIV-1基因组复制和转录延伸过程中发挥重要作用,后者则可促使HIV-1基因的表达由早期向晚期转化。非HIV-1复制所必需的调节基因有nef、vif>vpr
4、和vpu。这些基因的编码产物都冇各自的功能,有些尚未完全阐明,在此不一一赘述。2构建HIV-1载体系统的基木原理[7]HIV-1载体系统由两部分组成,即包装成分和载体成分。包装成分由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建,能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白;载体成分则与包装成分互补,即含冇包装、逆转录和整合所需的HIV顺式作用序列,同时具有界源启动了控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。为降低两种成分同源重组恢复成野生型病毒的可能,需尽量减少二者的同源性,如将包装成分上5’LTR换成巨细胞病毒(CMV)立即早期启动了、3’LTR换成SV4
5、0polyA等。包装成分通常被分开构建到两个质粒上,一个质粒表达Gag和Pol蛋fl,另一个质粒表达Env蛋口,其目的也是降低恢复成野生型病毒的可能。图1所示为Trono等建立的HIV-1载体系统中的一种[1]。将包装成分与载体成分的3个质粒共转染细胞(如人肾293T细胞),即可在细胞上清屮收获只有一次性感染能力而无复制能力的、携带口的基因的HIV-1载体颗粒。3HIV-1载体系统的改进近年來,已有多个实验室建立了复制缺陷的HIV-1载体系统,用于不同目的的研究,如分析病毒的感染力[8]、筛选抗病毒药物[9]、评价Env糖蛋口的不同区域在介导病毒进入细胞中的作用[10]等
6、。而目前对于以基因治疗为目的的HIV-1载体系统,研究的焦点集中在如何扩大其嗜性范围、确保其安全性及提供其滴度和转导能力上。1996年以来,Trono领导的课题组发表了一系列令人鼓舞的研究结果[1〜3],主要包括以下几方面的改进。3.1包膜蛋白最初的HIV-1载休颗粒,均由其本身的包膜蛋白Env所包裹,仅对CD4+的细胞具有亲嗜性o1996年,Trono课题组的Naldini等[1]设计的HIV-1载体系统(见图1)采用表达水疱性口炎病毒(VSV)糖蛋口G的质粒和双嗜性小鼠口血病病毒(MLV)包膜蛋白Env的质粒,分別取代表达HIV木身包膜蛋白Env的质粒,使HIV-1载
7、体颗粒包上了VSV或双嗜性MLV的包膜。这样做的结果至少具有三个方面的积极意义:①包膜的更换进一步降低了HIV-1载体恢复成野生型病毒的可能;②使HIV载体感染宿主的范围不再仅限TCD4+细胞,而扩大到几乎能感染所有组织来源的细胞;③VSV的包膜赋予HIV载体颗粒高度的稳定性,使其能够通过超速离心而浓缩,达到高滴度。Naldini等已使HIV-1载体滴度由105转录单位(TU)/ml达到108TU/ml。这样的改进无疑是HIV载体系统走向应用而边出的一大步。3.2包装成分包装成分的构建应在不影响重组病毒的装配和感染力的前提下,
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