用于肿瘤基因治疗的慢病毒载体研究进展论文

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1、用于肿瘤基因治疗的慢病毒载体研究进展论文【关键词】慢病毒载体;基因治疗;人类免疫缺陷病毒Ⅰ型;综述基因治疗有望成为治疗遗传病、肿瘤、病毒感染及其他难治性疾病的有效手段，但目前基因转移方法的局限性成为实现这一愿望的最大障碍。慢病毒(LV)属于逆转录病毒属的一个亚科，其中包括灵长类LV如人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIVⅠ)、HIVⅡ、猴免疫缺陷病毒(SIV)和非灵长类LV如Visna病毒、马传染性贫血病毒(EIAV)、山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)等7个亚属。其中对HIVⅠ的结构及生物学特性研究较多。HIVⅠ具有可

2、感染非分裂细胞、目的基因整合至靶细胞基因组长期表达、感染率高、免疫反应小等优点，弥补了逆转录病毒载体和腺病毒载体等病毒载体的缺陷，适于体内基因治疗，因此有望成为理想的基因转移载体。本文对该类载体的研究进展做一综述。1LV的基因结构1～3人类免疫缺陷病毒直径110～120nm，呈20面体对称结构，大致呈球形。病毒外膜是磷脂双分子层.freelportina、importinb及核孔蛋白。importina含有一个细胞定位序列(NKS)的结合位点，当含有NL的蛋白与importina结合发生构象变化，与importinb相互作用，然后importinb通过与核

3、孔蛋白结合，靶向作用于核孔复合物4。而在实际构建时，vpr可以完全敲除而不影响LV载体感染非分裂期细胞的能力。2LV载体系统的演进对LV载体进行改造使其具有高效的基因转移、长期稳定的基因表达及生物安全性一直是研究的热点。到目前为止，已有3代LV载体产生。第一代LV载体以来源于人的HIVⅠ研究最为广泛。保留顺式作用元件包括病毒本身的LTR以及病毒的包装信号ψ、Gag基因部分p17区域、Rev反应元件(RRE)。应用限制性内切酶等工具逐渐去除掉野生型LV复制所需要的Gag、Pol、Env基因，部分除掉vpu、vpr、vif、nef致病基因，以保证载体的生物安全性。由于这

4、种载体已经缺少形成完整病毒所需要的蛋白基因，所以它不能依靠自身基因形成完整的病毒颗粒5。而后将编码病毒衣壳和包膜结构的基因分别克隆于另外两个质粒中，一个表达Gag和Pol,另一个表达Env,即转移质粒、包膜表达质粒和辅助质粒。转移质粒带一个强启动子，如CMV启动子用来控制除Env以外所有病毒结构基因的表达，它还保留了病毒的LTR区并且被插入了外源基因，在转移质粒上人工插入标记基因(如LacZ、NeuoR、Gpt、Gfp)并可以在标记基因之后外源基因插入之前引入内部核糖体进入位点(IRES)，这样就可以由一个启动子来转录出一个双顺反子mRNA，而由不同的核糖体来分别翻译

5、出两种蛋白。第一代LV载体系统的特点是在构建3种包装质粒时，为了降低产生有复制能力的病毒(RCV)的可能性，尽可能减少3种质粒之间的同源序列，但包装质粒中仍然保留了HIV的辅助基因。第二代LV载体在生物安全性上作了大量的改进，包装结构基因质粒上进一步删去了编码辅蛋白Nef、Vif、Vpr的基因6，只保留了gag、pol、tat、rev，生物安全性进一步提高。第三代LV载体的主要特征是构建了自我失活型的质粒(删除了病毒3′端LTR上的U3)。因为在病毒整合宿主基因组后，病毒3′端LTR的U3发生跳跃后能启动病毒基因的转录。而U3是病毒的启动子，当删除病毒3′端LTR的U

6、3后，病毒基因组就不能复制，即使在发生病毒基因与宿主基因重组的情况下，病毒的基因组也不能被复制，因此只能转录整合目的基因，消除了产生活性病毒的可能性7。另一种改进是在LV载体包装结构基因质粒上进一步删去了tat基因。总之，第三代LV在不影响感染能力的前提下，其生物安全性大大提高。3三质粒表达系统根据以上原理，NALDINI等8和KAFRI等9构建了三质粒表达系统。三质粒系统是由包装质粒、包膜质粒及转移质粒组成的。其中包装质粒在CMV启动子的控制下，表达HIVⅠ复制所需的全部反式激活蛋白，但不产生病毒包膜蛋白及辅助蛋白Vpu;包膜蛋白质粒使用水疱性口炎病毒G蛋白(VS

7、VG)等异源性基因代替env基因，HIVⅠ载体的感染谱得以扩大，HIVⅠ载体颗粒获得高度稳定性并可在转移质粒中插入标志基因(绿色荧光蛋白GFP);转移质粒上还可以插入需要转入靶细胞的目的片段。通过三质粒共转染293T细胞,就可以生产复制缺陷的HIV病毒。4LV的基因治疗肿瘤基因治疗是继手术、放疗等传统治疗方法之后出现的一种全新的肿瘤治疗方法。LV载体能够将肿瘤治疗基因安全高效地转移到人体内，使治疗基因长期、稳定、高效的表达。目前在基础和临床方面取得了许多进展。TRONO10认为重组LV载体是目前最适合神经系统退行性疾病基因治疗的载体系统。LV载