基于第二代测序技术对蝇类携带细菌多样性的研究与应用

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1、分类号：___________密级:__________UDC:__________基于第二代测序技术对蝇类携带细菌多样性的研究与应用姓名：陈佩学号：2111541050院系：公共卫生学院学位类型：专业学位专业：公共卫生研究方向：疾病预防控制导师：何秋星副教授邱德义高级工程师论文提交日期：2018年6月5日论文答辩日期：2018年5月14日学位授予单位：广东药科大学二〇一八年六月StudyandapplicationofthediversityoffliescarryingbacteriabasedontheS

2、econd-GenerationSequencingTechnologyCandidate：ChenPeiStudentID：2111541050Affiliation：SchoolofPublicHealthAcademicDegreeApliedfor：ProfessionaldegreeofPublicHealthSpeciality：PublicHealthSupervisor：Prof.HeQiuxingAssistantSupervisor：Prof.QiuDeyiDayofDefence：May2

3、018Degree-Conferring-Institution：GuangdongPharmaceuticalUniversityJune2018广东药科大学硕士研究生学位论文广东药科大学硕士研究生学位论文基于第二代测序技术对蝇类携带细菌多样性的研究与应用摘要目的蝇类是一种重要的医学媒介生物，携带大量的细菌病原体，可直接或间接地传播疾病，与人类健康关系密切，因此对蝇类携带细菌进行检测分析，对于预防相应疾病的发生与流行具有重要意义。目前蝇类携带细菌检测方法的检测效率均较低，能检测出的细菌种类十分有限，无法反应样

4、品携带细菌的实际情况；第二代测序技术测序通量高，一次测序并可得到来自样品的全部核酸序列，为蝇类携带细菌的全面检测提供了可能。本研究将第二代测序技术用于蝇类携带细菌多样性的研究，旨在建立一种高效的蝇类细菌多样性的检测方法，为检验检疫工作提供参考。方法研究内容分为四个部分。第一部分，在振荡洗脱法的基础上，对蝇类携带细菌分离及收集方法进行优化，探究了两个影响其收集效率的条件，分别为洗脱次数和洗脱液收集量，通过单一因素的控制变量法，以细菌DNA的收集效率为指标，并结合实际操作的繁琐程度，得出最适洗脱次数和洗脱液收集量，

5、从而得到一种简便高效的蝇类携带细菌的分离及收集方法。第二部分，比较了细菌的六种DNA提取方法，包括：磁珠法、热裂解法、试剂盒法（有溶菌酶处理和无溶菌酶处理）、超声波法和超声+热裂解法；以10种细菌的等量混合液作为样品，用六种方法分别提取其细菌DNA，特异性扩增细菌16SrRNA的V3-V4区基因，并对PCR产物进行第二代测序，通过对六种方法的提取效率进行比较分析，分析的内容包括：提取的细菌DNA质量、PCR产物质量、测序结果对样品真实情况的反应程度（包括OTU丰度和细菌数量分布），从而得到最适的细菌DNA提取方

6、法。第三部分，对细菌16SrRNA基因不同高变区的测序结果进行比较研究，以大头金蝇作为实验样品，分别收集其体内和体外携带的细菌，提取细菌I广东药科大学硕士研究生学位论文DNA后，分别PCR扩增细菌16SrRNA的V1-V3、V3-V4及V4-V5区基因，并对PCR扩增条件进行探究，将PCR产物进行第二代测序，通过对三个测序区域的PCR产物质量和测序结果（包括数据量、物种丰度和多样性）进行比较分析，从而得到用于蝇类携带细菌研究的最适测序高变区；并通过分析蝇类体内和体外携带细菌的测序结果，了解蝇类体内和体外携带细菌

7、的差异。第四部分，以混合菌液和蝇类携带细菌为实验样品，对其PCR产物进行第二代测序和克隆测序分析，从两者测序成本和测序结果（包括数据量、重复性和物种多样性）方面进行比较分析，以了解第二代测序技术与克隆测序法的差异。结果第一部分：当洗脱4次时，可以收集到91.06％的细菌；当洗脱液收集量为全部收集时，收集到的细菌最多，且操作简便。第二部分：除了热裂解法提取出的细菌DNA纯度低，其余五种方法的细菌DNA质量均较好；热裂解法和超声+热裂解法的PCR产物中目的片段的总量低于1.5μg，无法直接满足测序建库的要求，其余四

8、种方法均满足；在第二代测序结果中，磁珠法和试剂盒法（有溶菌酶处理）的OTU丰度为9，菌种相对数量分布最均匀。第三部分：当退火温度分别为55℃、50℃和48℃时，细菌16SrRNAV1-V3区、V3-V4区和V4-V5区的PCR产物的电泳条带最好；三个V区所得到的PCR产物均能满足第二代测序建库的要求，其中V3-V4区的PCR产物的质量最好，其次为V1-V3区，V4-V5区的扩增质量最差