维生素对凡纳滨对虾n-乙酰-β-d-氨基葡萄糖苷酶的效应研究

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1、第27卷第4期台湾海峡Vol.27,No.42008年11月JOURNALOFOCEANOGRAPHYINTAIWANSTRAITNov.,2008维生素对凡纳滨对虾N2乙酰2β2D2氨基葡萄糖苷酶的效应研究121121杜娟,谢晓兰,黄乾生,王烨,王丽琴,陈清西(1.厦门大学生命科学学院、细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室,福建厦门361005;2.泉州师范学院化学与生命科学学院,福建泉州362000)摘要:以凡纳滨对虾中提取的N2乙酰2β2D2氨基葡萄糖苷酶(NAGase,EC3.2.1.52)为研究对象,以对2硝基苯2N2乙酰2β2D2氨基葡萄糖苷(pNP2NAG)为底物,考察了几种

2、养殖常用维生素对该酶活力的影响.结果表明,VB12、烟酸、核黄素等对酶活力基本上没有影响;而VB1、VB6、抗坏血酸等对该酶活力均有不同程度的抑制作用.随着抑制剂浓度增大,酶活力呈指数下降,测定导致酶活力下降350%的抑制剂浓度(IC50)分别为16.0、13.5、37.5mmol/dm.进一步研究了VB6的抑制作用动力3学,结果显示:VB6对酶的抑制作用为非竞争性可逆抑制,其对酶抑制常数(KI)为15.2mmol/dm.该研究对凡纳滨对虾的人工养殖具有一定的参考价值.关键词:凡纳滨对虾;N2乙酰2β2D2氨基葡萄糖苷酶;维生素;酶活力;抑制机理中图分类号:Q356.1文献标识码:A文章编号:

3、100028160(2008)0420422205几丁质酶系是由内切几丁质酶、外切几丁质酶和N2乙酰2β2D2氨基葡萄糖苷酶(NAGase,EC3.2.1.52)等3种不同组分组成的.对虾NAGase不仅与对虾生长发育过程中的周期性蜕皮及虾幼体的孵化密切相关,[1]还与食物消化吸收、抗菌防卫等有关.凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)是目前世界上3大养殖对虾中单[2]产量最高的虾种.近年来,随着凡纳滨对虾人工养殖规模的扩大,集约化程度的提高和养殖环境的日趋恶化,导致其疾病暴发,对虾的病害问题越来越受到人们的关注.除采用药物防治和优化养殖环境外,提高凡纳滨对虾自身的免疫力对病害的

4、防治有着重要意义,尤其是研究以增强非特异性免疫力为目的的饲料添加剂,[3]如维生素等,更具实际应用价值.维生素是维持凡纳滨对虾健康,促进其生长发育的必需物质,对维持凡纳滨对虾的代谢过程和生理机能[4]以及恢复组织创伤和抵御疾病侵袭均具有重要作用.维生素在动物体及饲料中含量很少,因此在水生动物饲料中合理地添加维生素,会提高养殖效果和经济效益,尤其对高密度集约化养殖方式,其效果可能更为[5][6,7]显著.曾有学者研究了中国对虾对各种维生素的需求量,但对凡纳滨对虾的研究很少.因此,研究维生素类对凡纳滨对虾NAGase的活力影响,对于NAGase催化机理的了解、不同生长期的食物调配具有重要的指导作用

5、.1材料与方法1.1材料与试剂[8]N2乙酰2β2D2氨基葡萄糖苷酶(NAGase)是从凡纳滨对虾内脏分离纯化得到的,为电泳单一纯.对2硝基苯2N2乙酰2β2D2氨基葡萄糖苷(pNp2NAG)购置于上海医药工业研究院生化室;结晶牛血清白蛋白是上海蓝季科技发展有限公司国产分装;三羟甲基氨基甲烷(Tris)等其他生化试剂均为国药集团化学试剂有限公司生产;VB12、烟酸、维生素B1、B6、抗坏血酸等为国产生化试剂;使用的蒸馏水为无离子重蒸水.1.2方法收稿日期:2007212226基金项目:福建省科技重点资助项目(2006N0067);中国博士后科学基金资助项目(20070410806)作者简介:杜

6、娟(1983～),女,硕士研究生.通讯作者:陈清西,男,教授(博导);E2mail:chenqx@xmu.edu.cn©1994-2010ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreserved.http://www.cnki.net4期杜娟等:维生素对凡纳滨对虾N2乙酰2β2D2氨基葡萄糖苷酶的效应研究·423·1.2.1酶蛋白浓度的测定酶浓度测定参考文献[8],采用Folin2酚法.31.2.2酶活力的测定酶活力的测定参考文献[9]:以pNp2NAG为底物,在2.0cm测活体系中,包含3330.1mol/dmpH5.2N

7、aAc2HAc缓冲液和0.25mmol/dm的底物,置37℃恒温水浴,加入10mm酶液,准确反33应10min,加入2cm0.5mol/dm的NaOH终止反应.在BeckmanUV2650型分光光度计上测定波长为405nm33的吸光度(OD405nm),光径为1cm,以pNP为产物对照,测得该条件下产物的消光系数为8.8×10dm/(mol·cm).3酶活力单位定义为在上述条件下,每分钟水解底物产