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1、学校代码：10255学号：2160646东华大学硕士学位论文AThesisSubmittedtoDonghuaUniversityfortheMaster’sDegree海栖热袍菌两种嗜热酶基因工程菌发酵条件优化OPTIMIZATIONOFFERMENTATIONCONDITIONSOFTWOENGINEERINGBACTERIATHATEXPRESSTHERMOPHILICENZYMESFROMTHERMOTOGAMARITIMA专业：生物工程作者：项欢校内导师：张兴群校外导师：李振勇答辩日期：2018年5月
2、25日东华大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日东华大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借
3、阅。本人授权东华大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本版权书。本学位论文属于不保密□。学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日东华大学硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名职称职务工作单位备注李玉林副教授答辩委员会主席华东理工大学孟清教授答辩委员会委员东华大学张兴群副教授答辩委员会委员东华大学曹张军副教授答辩委员会委员东华大学杨雪霞副教授答辩委员会委员东华大学李凯副教授答辩委员会委员东华大学林瑛副教
4、授答辩委员会秘书东华大学东华大学硕士学位论文海栖热袍菌两种嗜热酶基因工程菌发酵条件优化摘要随着生物技术的不断发展,越来越多的科研工作者致力于开发及利用极端微生物资源,许多极端环境中的微生物及其产生的酶,在工业生产上具有重大的应用价值和研究意义。海栖热袍菌(Thermotogamaritima)属于极端嗜热微生物,来源于深海火山,因其生长环境十分特殊,所以很难直接用于工业化大规模发酵培养。目前的主流方法是：利用基因工程手段克隆嗜热酶基因并转入合适的表达系统中使其高效表达,获得工业上所需的嗜热酶。本课题实验对象为从
5、海栖热袍菌中提取出的内切-β-1,4-葡聚糖酶(TM1525)和阿拉伯内切-β-1,4-半乳聚糖酶(TM1201)。研究两种蛋白酶的高效表达条件、检测两种酶的酶活性质以及利用正交实验法和响应面法对两种酶的发酵条件进行优化。本文主要研究的内容及结果如下：1、分别利用本实验室构建的两种酶重组表达质粒转化大肠杆菌Ecoli.BL21,获得两种工程菌，命名为TM1525工程菌和TM1201工程菌。2、利用IPTG诱导表达、SDS-PAGE电泳分析、Westernblot等方法分析表达情况，并优化了工程菌表达条件。3、利
6、用生物信息学软件分析两种酶的理化性质,采用Ni-NTA层析柱进行纯化,得到了纯度较高的两种酶并检测了酶活。I东华大学硕士学位论文4、通过单因素实验考察了起始菌液OD600值、培养时间、温度、IPTG量和培养液pH对工程菌对目的酶表达量的影响，确定主要因素，并以此为依据确定正交实验的因素和水平。5、利用Plackett-Burman实验、最陡爬坡实验、Box-Behnken实验得出响应面回归方程，进一步优化发酵条件。TM1525工程菌最优发酵方案为：起始OD600为0.8、培养基pH为7.0、培养时间为15h,酶
7、产量可达到约361.513mg/L,相比于优化前提高了约1.25倍;TM1201工程菌的最优发酵方案为:设置IPTG量为0.3mM、培养温度为18℃、接种量为3%,酶产量可达到约379.074mg/L相比于优化前提高了约1.28倍。关键词：内切-β-1,4-葡聚糖酶、阿拉伯内切-β-1,4-半乳聚糖酶、正交实验、响应面设计II东华大学硕士学位论文OPTIMIZATIONOFFERMENTATIONCONDITIONSOFTWOENGINEERINGBACTERIATHATEXPRESSTHERMOPHILICE
8、NZYMESFROMTHERMOTOGAMARITIMAABSTRACTWiththecontinuousdevelopmentofbiotechnology,moreandmoreresearchersarecommittedtothedevelopmentanduseofextremophilicmicrobialresources.Manymicrobesandtheirenzy
