吸附蛋白质固定相电色谱手性分离的研究

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1、第#&卷第5期色谱XMPY#&OMY5!""#年&月86QO;+;R4S=O,14T86=4@,U4V=,76W+B>IY!""#吸附蛋白质固定相电色谱手性分离的研究叶明亮，邹汉法，雷政登，吴仁安，倪坚毅（中国科学院大连化学物理研究所国家色谱研究分析中心，辽宁大连##)"##）摘要：将牛血清白蛋白（*+,）吸附于强阴离子交换固定相（+,-）上用于电色谱手性分离。当+,-吸附*+,后，电渗淌度仅仅下降!).%/，而电渗流的方向没有改变。在该系统中电渗流的方向和阴离子的电泳方向一致，因而克服了一般蛋白质固定相不能分离酸性对映体的缺点。#种中性对

2、映体安息香和(种阴离子性对映体色氨酸、华法令、非诺洛芬、酮基布洛芬获得了成功分离。当流动相含体积分数为’/的乙腈时，死时间和0$色氨酸、1$色氨酸的迁移时间的相对标准偏差分别为".&"/，".2’/和".&)/（!3!#），说明该体系有很好的重现性。为了缩短分析时间，将正己酸作为顶替试剂加入流动相中，结果发现对映体的保留下降很快而手性选择性减小缓慢。此外，还考察了乙腈的体积分数对分离的影响。关键词：毛细管电色谱；手性分离；蛋白质的吸附中图分类号：4)52文献标识码：,文章编号：#"""$2’#（%!""#）"5$"%&"$"5坏而丧失手性分

3、离能力。在填充环糊精的电色"$!前言谱中，可以通过在流动相中添加三乙胺使电渗流方许多蛋白质在结合对映体时有手性选择性。通向改变来分离酸性对映异构体［#5］，但这种方法有可过将蛋白质固定在合适的载体上，在高效液相色谱能使蛋白质丧失结合药物的能力而不能使用。为了（6718）中可以分离手性化合物，如牛血清白蛋白分离酸性对映体，蛋白质填料表面应带净正电荷，但（*+,）、!［#95］，都可#$酸性糖蛋白、人血清白蛋白等这类蛋白质固定相目前尚未出现。我们发现并报道以制成色谱填料用于手性分离。6718的主要缺点了强阴离子交换固定相（+,-）在吸附*+,后

4、有手是溶剂和样品的消耗量大、柱效低。毛细管区带电性拆分能力，能将0$色氨酸与1$色氨酸分开［#)］，但泳（8:;）是一种高效、微量的分离技术，蛋白质可以所报道的仅为取得的初步结果，没有进行深入研究。作为8:;的运行缓冲液的添加剂用于手性分由于在该电色谱体系中，电渗流仍然流向阳极，因此离［)9&］。但以蛋白质为添加剂的缺点是紫外吸收比较适合分离酸性对映体。本工作主要利用这种电太大，导致检测灵敏度低。毛细管电色谱（8;8）综色谱体系分离中性和酸性对映体，并系统考察了乙合了6718和8:;的优越性，具有高效、微量、选择腈的体积分数、顶替试剂的浓度

5、等对分离的影响。性高等特点，目前已有多篇以固载蛋白质为固定相［#"9#(］"实验部分进行手性拆分的报道。以固载蛋白为固定相的8;8成功地克服了在8:;中由于蛋白质紫外吸"#!仪器和材料收大而检测灵敏度低的缺点。7?,8;@0A型毛细管电泳仪（*BCDEFG公目前使用的蛋白质填料表面都带负电，电渗流司）。乙腈为色谱纯试剂，水为二次去离子水。5自阳极流向阴极，因此，阴离子性化合物由于其电泳粒径的+,-购自美国的HFIBJK7LFKB+B>FJF$!E方向与电渗流方向相反而不易出峰。1<等人［#%］发I

6、年光现布洛芬、萘普生、酮基布洛芬和非诺洛芬等酸性药纤厂，牛血清白蛋白购自华美公司，色氨酸购自中科物在填充!$酸性糖蛋白的电色谱中不出峰。一些院上海生物化学研究所，其他手性试剂购自+6值下以离子抑制模（#""EEMP?1，>6).5）。将适当体积的正己酸溶于式分离，但在低>6值下蛋白质的结构有可能被破水

7、中，用OF46溶液调至>6).5，配制!"EEMP?1收稿日期：!""#$"!$!%作者简介：叶明亮（#&’%$），男，博士。通讯联系人：邹汉法，男，博士，研究员，博士生导师，电话：（"(##）%)&%("&。第3期叶明亮等：吸附蛋白质固定相电色谱手性分离的研究·8P,·的正己酸储备液。流动相用适量乙腈、磷酸储备液、淌度减小了!128M，这意味着’(4填料表面的部水以及正己酸储备液（如果需要的话）混合配制，使分正电荷被&’(中和。但是电渗流方向没有改变，用前超声!"#$%。&’(的储备溶液（!)*+）用,"说明’(4填料表面仍带净正电荷，这

8、可能是由于##-.*+的磷酸溶液（/0123）配制。&’(是生物大分子，它不能接触到所有的正电基!"#电色谱柱的制备和分离条件团，所以仅能部分中和’(4表面的正电荷。实验发采用匀