超声微泡促进matrilin-2+shrna转染对肝卵圆细胞增殖影响的研究

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1、超声微泡促进Matrilin．2shRNA转染对卵圆细胞增殖影响的研究摘要【目的】1．建立一种新的体外留置性大鼠门静脉置管模型，探讨超声微泡经门静脉用药途径下促进目的基因在肝脏表达的作用，为体内肝脏靶向性基因的传送提供一种理想的方法。2．通过应用超声微泡介导的RNA干扰技术，探讨mat打lin．2对卵圆细胞增殖、分化的调控作用，为细胞外基质成分matrilin一2参与调控卵圆细胞增殖介导的肝再生提供科学依据。～【方法】1．大鼠体外留置性门静脉置管模型的建立：通过肠系膜上静脉属支，在导丝引导下将介入微导管插入门静脉内，固定并潜行于

2、皮下经颈背部引出体外，供药物注射用。2．EGFP质粒转染实验动物分组：将60只健康SPF级雄性SD大鼠随机分为A、B、C三组，每组20只大鼠。A组经尾静脉注射单纯EGFP裸质粒；B、C组分别经尾静脉和门静脉导管注射微泡与EGFP质粒混悬液，同时按设定参数和时间超声辐照肝区。3．分别于转染后24h、3d、7d、lld处死A、B、C三组大鼠获取肝脏组织，每个时间点处死4只大鼠。标本立即快速冰冻，488姗激发光荧光显微镜观察快速冰冻切片中EGFP表达，507啪的荧光照像，曝光时间均选择800ms，Imageproplus软件分析视野中

3、EGFP表达量与转染效率，同时病理切片观察肝组织结构。4．大鼠肝卵圆细胞增殖模型建立及实验动物分组：将90只健康SPF级雄性SD大鼠随机分为D、E、F三个组，每组30只大鼠。D组建立单纯大鼠肝卵圆细胞增殖模型；E、F组建立卵圆细胞增殖模型同时分别经尾静脉、门静脉在超声微泡介导下转染matrilin．2sIlI矾A质粒。5．于肝切除术后第4、8、12、16、20天处死D、E、F三组大鼠获取肝脏组织，每个时间点处死5只大鼠。切取一部分立即快速冰冻切片，并于荧光显微镜下观察EGFP表达；另一部分用10％中性甲醛固定，用于制作病理切片，

4、观察各组各时间点HOC形态及增殖情况，SP免疫组织化学技术检测卵圆细胞标志OV-6表达；最后切取一部分组织保存于液氮，备实时定量PCR方法检测各组各时间点肝脏组织中matrilin．2mRNA的表达。6．运用SPSSl8．0软件包对matrilin．2mRNA表达量与HOC计数进行spea咖aIl线性相关分析。【结果】1．建立体外留置性门静脉置管模型的20只大鼠中，2只大鼠因术中操作致出血死亡，术后15h出现1只大鼠死亡，解剖发现死亡原因为导管从血管中脱出导致出血，其余17只大鼠全部存活，总存活率为85％。2．EGFP在肝脏的表

5、达情况：A、B、C三组大鼠转染后24h发现少量荧光于肝脏表达，第3天达到高峰，A组3天后逐渐减少，至第7天荧光基本消失；B、C两组转染后且第7天仍持续表达，此后减少，第11天仅见微量荧光表达：转染后第3天及第7天B、C两组转染效果较A组均明显增强(p<0．01)，转染后第3天C组较B组转染效果略有增强(p<0．05)。3．肝卵圆细胞增殖模型大鼠一般情况：D组，即单纯卵圆细胞增殖模型组大鼠术后活动减少、精神差，随后出现毛松无光泽、尿黄、腹水，3只大鼠死亡，死亡率10％，鼠尾静脉(E)和门静脉(F)质粒注射干扰组被毛松乱更明显、尿黄

6、，腹水增多，死亡率分别为13．3％和20％。4．肝卵圆细胞增殖模型大鼠形态学与组织学变化：D组大鼠肝脏代偿性增大、充血、肝缘圆钝，表面及切面可见散在圆形点状病灶、不凸出肝表面，部分见出血点。镜下肝细胞水肿、肝索结构紊乱，汇管区增生反应，可见圆形或卵圆形、胞浆少、核质比高的HOC，术后20天结构完全恢复，恢复后肝索排列整齐。E、F两组和D组相比，肝脏出血点明显，点状病灶增多，镜下肝细胞水肿严重，肝索结构紊乱，汇管区增生反应较模型组少，术后20天恢复后肝索结构较D组紊乱。25．免疫组织化学检测OV-6表达：D组术后4天于汇管区可见O

7、V-6表达阳性的细胞，第8天阳性细胞数明显增多，第12天阳性细胞数达到高峰，开始离开汇管区想小叶中央迁移，部分OV-6阳性细胞己开始分化，第16天OV-6阳性细胞数明显减少，第20天仅见极少数OV6阳性细胞。E、F两干扰组与D组相比，第8天及第12天OV-6阳性细胞数减少(p

8、生理水平略高。7．将HOC计数与matrilin．2mRNA表达量行线性相关分析：D组相关系数r=0．79，有统计学意义(P<0．05)；E、F组相关系数分别为r=0．76、F0．74(p