禽网状内皮组织增生症病毒感染对spf鸡主要免疫器官白细胞介素2产生影响

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1、山东农业人学硕{．_号业学位论文中文摘要禽偏肺病毒(Avianmetapneumovirus．aMPV)于20世纪70年代末首次在南非报道，现已在许多国家都有分布。该病毒主要引起火鸡和鸡的上呼吸道或中枢神经系统疾病，如火鸡鼻气管炎(Turkeyrhinotraeheitis，TRT)和肉鸡的肿头综合征(S,a，ollenheadsyndrome，SES)。根据对G蛋白核苷酸序列分析和单克隆抗体中和试验将禽偏肺病毒分为A、B、C、D四个亚型(JuhaszandEaston，1994)。其中A亚型和B亚型禽偏肺病毒主要分布于欧洲和亚洲一些国家以及中东

2、地区，C亚型和D亚型分别在美国和法国报道。我国于1999年首次分离并报道了该病毒，从而证实我国也有aMPV的流行。郭龙宗等2008年血清学调查显示山东省部分地区肉种鸡感染率可达100％。OwoadeA．A．等2008年采用RT．PCR的方法对我国南方部分省市的鸡群进行了检测，结果A亚型阳性检出率达到39％，B亚型为阴性。为了进一步了解我国aMPV的流行情况，本研究重点从诊断方法的建立方面进行研究，从而为本病的防制提供理论依据。本研究内容分为两部分：一、B亚型禽偏肺病毒RT．LAMP快速检测方法的建立与应用利用PrimerExplorerV4在线软

3、件设计了一套针对B亚型禽偏肺病毒F基因的特异性引物，并从反应时间、温度、各组分浓度等方面优化了反应体系和反应条件，建立了B亚型禽偏肺病毒逆转录环介导等温核酸扩增(RT．LAMP)快速检测方法。该方法能够在63℃条件下lh内实现B亚型禽偏肺病毒F基因片段的特异性扩增，与其他病毒，如H9N2亚型禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)等的核酸无交叉反应。反应结果可直接用肉眼判断。对质粒DNA的最小检测量为1×102copies／pL。利用建立的检测方法对20份疑似禽偏肺病毒样品进行检测，

4、其阳性检出率为10％。结果表明，建立的B亚型禽偏肺病毒RT．LAMP检测方法具有快速、准确、特异性强、灵敏度高的特点，可应用于相关疾病的临床诊断。二、B亚型禽偏肺病毒SYBRGreenI荧光定量PCR检测方法的建立根据GenBank登录的B哑型禽偏肺病毒(登录号：JN224985．1)的F基因序列设计l对特异性引物，经RT．PCR扩增出214bp的片段。回收目的片段并与pMDl8．TVector连接后转化到琏闪工程荫DH5a中，提取重组质粒，经双酶切及测序鉴定后，B哑型禽偏啼俩毒}=：j!测方法的建椤’j心用作为阳性模板建立SYBRGreenI荧

5、光定量PCR标准曲线，并做敏感性试验、特异性试验和重复性试验。结果表明，标准曲线循环阂值与模板浓度呈良好的线性关系，产物Tm在83．3～83．8。C之间，灵敏度为7．9×102拷贝／gL，特异性和重复性较好。本试验建立了检测B亚型禽偏肺病毒的SYBRGreenI荧光定量PCR方法，为该病的早期诊断以及感染程度的定量分析奠定了基础。关键词：B亚型禽偏肺病毒：RT．LAMP；荧光定量PCR：SYBRGreenI山东农业人学硕卜号业学位论文EstablishmentofDetectionMethodsforAvianMetapneumoVirussub

6、groupB一AbstractAvianmetapneumoviruswasfirstdescribedinSouthAfricainthe1970S，whichmainlycausesupperrespiratorytractorcentralnervoussystemdiseasesinturkeysandchickens，suchasTurkeyrhinotracheitisandSwollenheadsyndrome．ApartfromAustralasia，allmajorpoultryraisingregionsoftheworldh

7、avereportedthepresenceofaMPV．Avianmetapneumoviruseshasbeenfurtherclassifiedintofoursubtypes(A，B，C，D)basedonnucleotidesequencedivergenceintheattachmentglycoprotein(G)geneandantigenicdifferences(JuhaszandEaston，1994)．SubtypesAandBarereportedinEurope，Asia，andtheMiddleEastcountri

8、eswhilesubtypesCandDarerespectivelyreportedintheUnitedStatesandFranc