沉默sept9基因对人肝癌mhcc97-h细胞生物学特性的影响

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1、中图分类号：R89；R36；R39硕士学位论文沉默SEPT9基因对人肝癌MHCC97-H细胞生物学特性的影响院（系）、所基础医学院研究生姓名马秉福学科、专业病理学与病理生理学导师姓名税青林教授二Ο一三年四月目录1沉默SEPT9基因对肝癌MHCC97-H细胞生物学特性的影响……11.1中文摘要………………………………………………………11.2英文摘要………………………………………………………41.3前言……………………………………………………………81.4材料与方法……………………………………………………111.5结果……………………………

2、………………………………241.6讨论……………………………………………………………341.7结论……………………………………………………………421.8参考文献………………………………………………………431.9英汉缩略词对照表……………………………………………482致谢……………………………………………………………493综述……………………………………………………………50沉默SEPT9基因对肝癌MHCC97-H细胞的生物学特性的影响摘要目的：根据SEPT9基因序列设计并合成相应SEPT9-siRNA，探讨SEPT9-siRNA对人肝

3、癌细胞系MHCC97-H细胞生长特异性抑制作用及其凋亡的影响，进一步揭示SEPT9基因在肝癌发生发展过程中的作用。方法：根据SEPT9基因核苷酸序列设计4对针对SEPT9基因的靶序列，由生物公司构建4个针对SEPT9基因的siRNA，同时构建不针对任何基因的带有绿色荧光蛋白基因的siRNA，预实验筛选出一个有效siRNA，其靶序列为GGCAGCCCATCATGAAGTTCA。培养MHCC97-H细胞，待细胞生长状态良好并达到指数生长期时，于转染前一日接种于6孔板（CCK-8法检测MHCC97-H细胞生长抑制情况用96孔板接种），设实验组、

4、阴性对照组和TM空白组。以每孔脂质体Lipofectamine20007.5ug，重组siRNA3ug配成转染复合物，加入各孔MHCC97-H细胞中进行转染（空白组不加任何试剂）。转染后48h荧光显微镜下观察绿色荧光细胞所占比例，判断转染效率。①RT-PCR法检测SEPT9mRNA的表达抑制情况：转染后48h，提取各组细胞总RNA，逆转录合成cDNA，并经PCR反应扩增，琼脂糖凝胶电泳，最后凝胶成像分析系统吸光度扫描观察结果。②用westernblot法检测SEPT9蛋白质的表达抑制情况：转染后48h，提取各组细胞总蛋白，BCA法测定蛋白

5、浓度，以GAPDH蛋白为内对照进行SDS-PAGE电泳，半干法转膜，一抗、二抗杂交孵育，化学发光液显影并用紫外凝胶成像分析系统自动曝光，结果用凝胶成像仪扫描QuantityOne4.4.0软件分析，检测各组1SEPT9蛋白的相对表达量。③以0h、24h、48h、72h为时间点，用CCK-8法检测SEPT9-siRNA对细胞生长抑制的影响。④转染后48h用流式细胞技术AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测各组MHCC97-H细胞凋亡率。⑤细胞划痕实验检测各组MHCC97-H细胞0h、24h、48h、72h的迁移率。结果：①转染后48h荧

6、光显微镜下观察，根据发绿色荧光的MHCC97-H细胞所占比率判断LipofectamineTM2000转染MHCC97-H细胞的转染效率达75％以上。②RT-PCR法检测结果显示：实验组SEPT9条带亮度明显弱于两对照组，灰度扫描半定量结果显示实验组MHCC97-H细胞中SEPT9mRNA表达水平显著底于两对照组。③免疫印迹分析显示：各组内对照GAPDH蛋白条带的亮度相似，而septin-9蛋白条带亮度实验组明显弱于其它两组。QuantityOne4.4.0软件分析结果显示，实验组、阴性对照组、空白组septin-9蛋白的相对表达量分别为

7、0.448±0.044、1.844±0.047、1.876±0.036。经SNK-q检验方差分析，实验组septin-9蛋白相对表达量分别与空白组及阴性对照组相比，均下降76％左右，差异有统计学意义（P<0.01），而其它两组之间相比，无显著性差异（P>0.05）。④CCK-8法检测结果显示；在0h~72h范围内，实验组与空白组、阴性对照组的OD值相比较，差异具有显著性（P<0.01），其它两组之间相比，无显著性差异（P>0.05）；表明SEPT9-siRNA对MHCC97-H细胞生长有明显抑制作用。⑤流式细胞仪检测显示：空白对照组、阴性

8、对照组、实验组转染72h细胞凋亡率分别为(28.28±3.45)%、（5.65±1.56）%、（5.33±1.81）%，经q检验方差分析，实验组转染后12h细胞凋亡率即开始升高(P﹤0.01)