巴美肉羊发情期血清生殖激素和卵巢micrornas的鉴定及功能分析

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1、分类号S813.3学校代码10129UDC636学号2009301012巴美肉羊发情期血清生殖激素和卵巢microRNAs的鉴定及功能分析CharacterizationofSerumReproductiveHormonesandOvarianmicroRNAsofBameiMuttonSheepDuringEstrus申请人：祁云霞学科门类：农学学科专业：动物遗传育种与繁殖研究方向：分子遗传与牛羊育种指导教师：荣威恒研究员论文提交日期：二〇一三年六月本研究由“国家科技支撑计划项目”（编号：2011BAD28B05）、“国家现代肉羊产业技术体系”（编号：CARS-3

2、9）和“家养动物种质资源平台”资助Theworkwassupportedbythe“NationalScienceandTechnologySupportProgram”(No.2011BAD28B05)、“ChinaAgricultureResearchSystem-39”(No.CARS-39)andthe“GermplasmResourcesPlatformofDomesticAnimals”摘要繁殖性状是养羊业的重要经济性状之一，增加绵羊每胎产羔数是降低生产成本、提高生产效率的有效措施，具有重要意义。绵羊产羔数的多少受排卵数的影响，而卵泡发育是一个极其复杂且

3、高度协调的过程，受到来自下丘脑、垂体和卵巢的内分泌、旁分泌/自分泌因素和多种生长因子的精密调节。然而到目前为止，卵泡的发育、成熟、排卵及造成排卵数差异的分子机制还未完全明了。近年来发现的microRNAs在机体生长发育、分化、代谢和疾病等许多生物过程发挥作用，其在哺乳动物生殖中的作用也逐渐受到重视。本研究以巴美肉羊为实验对象，采用ECLIA和miRNAmicroarray技术，从生殖内分泌激素和microRNAs两个层面入手，研究巴美肉羊发情期生殖激素变化规律和卵巢microRNAs表达谱，分析经产单、双羔母羊血清生殖激素分泌和卵巢microRNAs表达差异，初步探

4、讨造成绵羊产羔数差异的因素及其分子调控机理。1、巴美肉羊发情期血清生殖激素变化规律及其与产羔数关系研究采用ECLIA技术，分析4种生殖激素FSH、LH、E2和P4在单、双羔巴美肉羊发情期外周血中的分泌规律和特点，探讨生殖激素与产羔数的相互关系。结果表明：（1）血清中FSH和LH均呈脉冲式分泌，单、双羔母羊血清FSH在发情后的1h都出现一个峰值（P＜0.001），LH在发情后的12～24h出现峰值；血清中E2和P4在单、双羔组间变化规律不同：单羔羊E2呈“V”字形变化趋势，双羔羊E2总体呈下降趋势；单羔羊P4呈上升趋势，双羔羊P4呈倒“V”字形变化趋势。（2）方差分析

5、显示，双羔羊FSH水平在发情后1h极显著高于单羔羊（P＜0.001），12h显著高于单羔羊（P＜0.05）；双羔羊LH水平在发情后12h极显著高于单羔羊（P＜0.001），24h显著高于单羔羊（P＜0.05）。结果表明，巴美肉羊产羔数增加可能与血清FSH和LH浓度升高有关。（3）血清中E2和P4各时间点的浓度水平，在单羔组和双羔组间羊均无显著差异（P＞0.05），但这两种激素在单、双羔组间呈现不同的变化规律，其与巴美肉羊繁殖力关系有待进一步研究。2、巴美肉羊卵巢组织microRNAs表达研究及差异表达microRNAs的筛选、鉴定和特征分析（1）应用多物种miRNA

6、芯片对3例产单羔母羊及3例产双羔母羊的卵巢组织进行miRNAs表达分析。结果，在检测的来自所有物种的miRNAs中，有5448个miRNAs在绵羊6个卵巢组织样本中共同表达，22个miRNAs在单羔组样本中特异表达，15个miRNAs在双羔组样本中特异表达。在检测的来自绵羊的103个miRNAs中，有47个miRNAs在6个样本中共同表达。（2）对来自绵羊的103个miRNAs进行差异表达分析。双羔绵羊与单羔绵羊相比，共获得卵巢组织差异表达miRNAs11个，其中上调表达4个（FoldChange≥2），下调表达7个（FoldChange≤0.5）。这些miRNAs

7、可能与绵羊卵泡发育和产羔数多少有关。随机选择芯片结果中上、下调表达的基因oar-miR-381-5P和oar-miR-1185-5p，利用miRNARealTimeRT-PCR技术进行验证，结果表明miRNA芯片结果准确、可信。（3）生物信息学分析得知，筛选获得的11个差异表达miRNAs中，除oar-miR-544-5p与绵羊参考基因组无相似序列外，其余miRNAs均是位于绵羊18号染色体上的内含子miRNAs。分别利用2种方法（microT法和miRDB法）预测差异表达miRNAs的靶基因，取二者交集，共获得7个miRNAs的靶基因：oar-miR-370-