尖吻蝮蛇血凝酶的生化及免疫学特性

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1、南方医科大学2010级硕士学位论文尖吻蝮蛇血凝酶的生化及免疫学特性BiochemicalandImmunologicalcharacteristicsofSaculin课题来源：企、事业单位委托项目学位申请导师姓专业名培养类培养层所在学人黄莹名庞建新称药理学型非定向次硕士研究生院药学院答辩委员会主席刘培庆答辩委员会委员黄芝瑛雷林生徐江平张嘉杰2013年05月29日广州硕士学位论文尖吻蝮蛇血凝酶的生化及免疫学特性研究硕士研究生：黄莹指导老师：庞建新教授摘要研究背景与目的：蛇毒类凝血酶(thrombin-likeenzymes，TL

2、Es)是蛇毒中与凝血酶作用机制部分相似的一类蛋白水解酶。它们属于丝氨酸蛋白酶，能够水解纤维蛋白原为纤维蛋白，具有体外促凝，体内降纤的作用。蛇毒类凝血酶因其临床应用价值而被广泛研究，如瑞士产止血剂立止血(Reptilase，商品名)就是从巴西矛头蝮蛇(BothropsatroxMoojeni)中提取出的类凝血酶，国内外已广泛用于出血性疾病及手术前后出血的临床防治。我国对尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的研究，最早是1967年的ChengHC和OuyangC等，他们于1971年和1972年相继分离出两个类凝血酶组分，经动物实验证实均有不同程度的

3、抗凝作用。1993．2005年，唐松山等经过12年的努力，从尖吻蝮蛇蛇毒中获得了5个新的类凝血酶，并对其进行了相关的研究。尖吻蝮蛇血凝酶也是一种从尖吻蝮蛇毒液中提取分离出来的蛇毒类凝血酶，目前研究显示该酶具有良好的止血作用。2009年北京康辰医药股份有限公司将其作为国家一类新药上市销售，商品名“苏灵”，代号Saculin。该凝血酶是迄今为止我国上市产品中唯一完成全部氨基酸测序的单一组分蛇毒类止血药，其止血效果良好，而且不良反应轻，耐受性好。本实验对Saculin作为一种类凝血酶的部分生化特性及其裂解纤维蛋白原作用进行了研究，明确

4、了该酶的作用特点。同时，对其免疫学特性进行了研究，建立了尖吻蝮蛇血凝酶多克隆抗体检测的间接ELISA法，并将其应用于临床血清抗体的检测。摘要方法和内容：1．尖吻蝮蛇血凝酶的生化特性研究1．1pH值对酶凝血作用的影响将Saculin溶于pH值从4-9的缓冲液中，每次分别各取0．2mL的8U／mLSaculin溶液与0．2mL的牛血浆混合，血凝仪测定其凝血时间，确定Saculin的最适pH值。1．2温度对酶凝血作用的影响将1mL的Saculin水溶液与1mL的牛血浆分别于不同温度(20．50oC)下孵育3mill后于玻璃试管中混合，

5、此时开始计时至刚开始出现浑浊为终点，记录凝血时间，以确定Saculin的最适温度。1．3Ca：+对酶凝血作用的影响用注射用水配制8mg／mL人纤维蛋白原溶液和1U／mLSaculin溶液，37。C孵育3min后分别取等量100vL混合，并在混合液中加入20止不同浓度的CaCl2溶液，使混合液中CaCl2的浓度为0．45．9．0mM，血凝仪测其凝固时间，以确定Ca2+对Saculin凝固纤维蛋白原作用的影响。1．4尖吻蝮蛇血凝酶释放纤维蛋白肽作用以0．05mol／LTris-HCl(pH7．4)缓冲液分别配制20mg／mL人纤维蛋

6、白原溶液、4U／mLSaculin溶液、8U／mL人凝血酶溶液。以上溶液配制好以后均于37。C充分水浴后使用。每次取4U／mLSaculin溶液、8U／mL人凝血酶溶液各1mL，均加入人纤维蛋白原溶液0．5mL混合均匀，37oC下分别孵育10min、30mill、lh、2h、10h。每个反应体系孵育凝固后的产物，均于100oC沸水中煮5rain以终止反应，产物13000rpm离心10rain，取上清液进行高效液相色谱分析，查看其裂解的肽片段，并以纤维蛋白肽A(FpA)、纤维蛋白肽B(FpB)标准品作对照。2．尖吻蝮蛇血凝酶免疫学

7、特性研究2．1多克隆抗体制备取体重2蚝左右的雄性新西兰兔，于免疫前耳静脉取血2mL，分离制备血清，TT硕士学位论文．20。C冷冻保存作为对照。初次免疫将1mg尖吻蝮蛇血凝酶溶于3mL生理盐水，与等体积的福氏完全佐剂超声乳化均匀后，对新西兰兔进行背部及肩胛部皮内、皮下多点注射(3mL／只)。3N后进行加强免疫注射，将0．5mg尖吻蝮蛇血凝酶溶于3mL生理盐水，与等体积福氏不完全佐剂超声乳化后，进行皮下多点注射(3mL／只)，以后每隔2周进行同样的加强免疫注射一次，共3次。初次免疫及每次加强免疫5．7天后均于兔耳缘静脉采血2mLN备

8、血清。用双向免疫扩散实验测定血清的抗体效价，以检验是否有抗体产生，最后一次免疫10d后，从颈动脉取全血约100mL，室温凝固后置4。C冰箱冷冻保存4h，离心分离血清，一20oc冻存备用。2．2抗体滴度测定采用双向免疫扩散法，以0．05mol／LpH7．8的磷酸缓